腺病毒載體介導(dǎo)的可溶性VEGF受體Flt-1（sFlt-1）抑制多發(fā)性硬化單核-巨噬細(xì)胞浸潤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、Y 14 0 6 8 5 6中山大學(xué)博士學(xué)位論文腺病毒載體介導(dǎo)的可溶性V E G F 受體F l t - 1 ( s F l t - 1 )抑制多發(fā)性硬化單核／巨噬細(xì)胞浸潤的實(shí)驗(yàn)研究A d e n o v i r u sM e d i a t e d S o l u b l e V E G F R e c e p t o r F l t - I ( s F I t —1 1G e n e D e l i v e r y I n h i

2、b i t sM o n o c y t e L i n e a g e C e l l s R e c r u i t m e n ti ne x p e r i m e n t a la u t o i m m u n e e n c e p h a l o m y e l i t i s博士研究生：朱燦勝學(xué)科、專業(yè)：神經(jīng)病學(xué)導(dǎo) 師：胡學(xué)強(qiáng)教授答辯委員會主席答辯委員會委員中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院廣州二o o 七年六月二日中山大學(xué)博士學(xué)位

3、論文競爭結(jié)合V E G F ，并且能與膜表面受體F i t ．1 及K D R 形成同源或異源二聚體，中止活化信號的傳遞，從而阻斷V E G F 的生物學(xué)活性，因此s F l t ．1 可能是V E G F 體內(nèi)天然抑制劑。目前國外已有利用s F l t ．1 進(jìn)行抑瘤研究的報(bào)道，且收效較為顯著。V E G F 對單核細(xì)胞具有趨化作用，誘導(dǎo)其遷移。單核／巨噬細(xì)胞表達(dá)F i t ．1 ，在受到巨噬細(xì)胞抗原刺激后表達(dá)上調(diào)。V E G F 的

4、趨化作用認(rèn)為是通過這一受體實(shí)現(xiàn)的。因此，利用V E G F 體內(nèi)天然抑制劑s F l t ．1 可以在體內(nèi)封閉M SC N S 內(nèi)升高的V E G F ，抑制其對炎癥細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞的趨化作用，從而達(dá)到治療的目的。研究方法：1 ) 通過P C R 方法擴(kuò)增s F l t ．1 ( 1 —3 ) 基因，然后應(yīng)用腺病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建攜帶人s F l t ．1 ／F L A G 融合基因的重組腺病毒載體( A d ．s F l t ．1 ／F

5、 L A G ) 。應(yīng)用E L I S A 、免疫組織化學(xué)、免疫熒光化學(xué)和W e s t e r n ．b l o t 法檢測所構(gòu)建的重組腺病毒載體在真核細(xì)胞中的表達(dá)。通過T r a n s w e l l 巨噬細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)和M a t r i g e lp l u g 分析，進(jìn)一步證實(shí)重組腺病毒所表達(dá)目的的生物學(xué)功能；2 ) 選取D A 大鼠作為實(shí)驗(yàn)動物，應(yīng)用豚鼠脊髓加完全福氏佐劑制成勻漿誘導(dǎo)E A E 模型；3 ) 應(yīng)用F E R

6、I D E X M R I 檢查監(jiān)測E A E C N S 內(nèi)單核／巨噬細(xì)胞的浸潤情況；4 ) 通過側(cè)腦室注射A d ．s F l t ．1 ／F L A G 阻止E A E C N S 內(nèi)單核／巨噬細(xì)胞浸潤，并通過發(fā)病情況、病理改變、免疫組織化學(xué)、免疫熒光化學(xué)觀察，評價(jià)治療效果結(jié)果：成功構(gòu)建了A d ．s F l t 一1 ／F L A G ，P C R 檢測證實(shí)無野生型腺病毒及腺相關(guān)病毒的污染，E L I S A 、免疫組織化學(xué)、免

7、疫熒光化學(xué)和W e s t e r n ．b l o t 法檢測顯示所構(gòu)建的腺病毒載體攜帶的基因能夠在真核細(xì)胞中得到表達(dá)。T r a n s w e l l 巨噬細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)和M m r i g e l p l u g 分析顯示V E G F 對巨噬細(xì)胞具有趨化作用，而s F l t ．1 蛋白具有抑制V E G F對巨噬細(xì)胞趨化作用。選擇D A 大鼠可成功誘導(dǎo)E A E 模型，通過常規(guī)M R I 檢查可發(fā)現(xiàn)E A E 動物模型腦部病灶

8、，F(xiàn) E R I D E X 增強(qiáng)M Ⅺ檢查可以監(jiān)測E A EC N S 巨噬細(xì)胞浸潤情況。A d ．s F l t ．1 ／F L A G 側(cè)腦室注射組動物發(fā)病率為5 0 ％，臨床評分為2 ．0 士1 ．o o ，與側(cè)腦室注射P B S ( 發(fā)病率1 0 0 ％，臨床評分3 ．4 士1 ．0 7 ) 和A d ．e G F P ( 發(fā)病率8 7 ．5 ％，臨床評分3 ．3 士0 ．9 7 ) 組相比，差異具有顯著性。免疫組化及免疫熒光

9、染色發(fā)現(xiàn)E A EC N S 組織，尤其是脊髓，有大量的V E G F 表達(dá)細(xì)胞，主要為星形膠質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)有伴有巨噬細(xì)胞浸潤。A d ．s F l t ．1 ／F L A G 側(cè)腦室注射可以抑制E A EC N S 內(nèi)單核／巨噬細(xì)胞的浸潤，從而降低E A E 的發(fā)病率和改善E A E 病情。結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了人s F l t ．1 基因重組腺病毒( A d —s F l t ．1 ／F L A G ) ，并融合F L A G 標(biāo)簽；