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文檔簡介
1、本項研究包括三部分:1.2型糖尿病家系中高甘油三酯血癥患者脂蛋白脂酶基因分子篩查 目的:對成都地區(qū)漢族人群2型糖尿病(T2DM)家系中伴高甘油三酯血癥(HTG)患者進行脂蛋白脂酶(LPL)基因分子篩查。方法:選取成都地區(qū)漢族人群中符合入選條件的T2DM家系,從T2DM家系中選擇TG≥2.25mmol/L的患者進行LPL基因分子篩查,53人符合此標準,其中T2DM患者31人,糖耐量減低者(IGT)11人,糖耐量正常(NGT)者11
2、人,這53人共代表了26個T2DM家系,TG范圍在2.3-13.0mmol/L。正常對照118例。用聚合酶鏈反應-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)和聚合酶鏈反應-變性高效液相色譜(PCR-DHPLC)對LPL基因進行突變檢測,然后對檢出的突變位點通過DNA序列分析進一步證實,對發(fā)現(xiàn)突變位點的家系成員進行篩查,同時在正常群體中篩查這些突變位點的頻率。對所有研究對象均進行血糖、血脂和胰島素測定,計算體重指數(shù)(BMI)。 結(jié)果:1.
3、在LPL基因外顯子檢測到7種突變,分別是:Ala71Thr、Val108Val、Leu286Pro、Asn291Ser、Lys312insC、Thr361insA和Leu376Leu。其中Lys312insC、Thr361insA和Leu376Leu是本研究中新發(fā)現(xiàn)的突變位點,以前從未報道過。 2.對新發(fā)現(xiàn)的Lys312insC和Thr361insA突變位點在家系成員中進行進一步篩查,結(jié)果顯示8#家系同時攜帶了Asn291Ser
4、和Lys312insC突變,這兩突變相互間有協(xié)同效應,并與家系中HTG呈共分離現(xiàn)象。在14#及28#家系中均發(fā)現(xiàn)了Thr361insA突變,通過家系內(nèi)關聯(lián)分析顯示Thr361insA突變與家系中HTG呈顯著相關。上述突變均未在正常對照中檢測到。 3.在新1#和新3#家系的先證者中篩查到了Leu286Pro和Ala71Thr突變,其中新1#家系的先證者是一位39歲男性,其TG為11.9mmol/L;新3#家系的先證者為一位40歲的
5、男性,其TG為13.0mmol/L,由于Leu286Pro和Ala71Thr突變曾經(jīng)被報道過,并且均進行了體內(nèi)及體外的功能研究,顯示這兩者突變均可以導致其產(chǎn)物LPL活性缺乏,從而使血中TG極度升高。因此考慮Leu286Pro和Ala71Thr突變是這兩個家系成員HTG的直接原因。 結(jié)論:在成都地區(qū)漢族人群T2DM家系中伴HTG患者LPL基因的突變頻率較高;部分家系的HTG是由于LPL基因突變直接導致的。 2.野生型人LP
6、LcDNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建、克隆和鑒定 目的:獲取野生型人LPLcDNA重組質(zhì)粒,為下一步進行LPL基因的體外定點突變及體外表達提供一個必要條件。 方法:逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法從人的大網(wǎng)膜脂肪組織獲取人LPLcDNA基因,選用pcDNA3.1Zeo(+)質(zhì)粒作為載體,運用基因克隆技術(shù)構(gòu)建野生型人LPLcDNA重組質(zhì)粒;對重組質(zhì)粒進行限制性內(nèi)切酶酶切、PCR以及雙向測序鑒定。 結(jié)果:經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切及PC
7、R鑒定證實LPL基因已克隆到pcDNA3.1Zeo(+)質(zhì)粒中,DNA雙向測序證實與基因庫中LPL基因的序列完全一致。 結(jié)論:成功構(gòu)建了野生型人LPLcDNA重組質(zhì)粒,為下一步進行LPL基因的體外定點突變及體外表達奠定了實驗基礎。 3.LPL基因的體外定點突變及體外表達 目的:對LPL基因進行Asn291Ser、Lys312insC、Thr361insA及Asn291Ser+Lys312insC定點突變;同時在體
8、外研究這四個突變LPL基因的功能。 方法:采用定點突變試劑盒對LPL基因進行體外定點突變;采用了陽性脂質(zhì)體Lipofectamine2000將重組pcDNA3.1Zeo(+)-LPLcDNA質(zhì)粒導入COS-1細胞;細胞培養(yǎng)分7組:空白對照組即不給予任何干預,陰性對照組即用空質(zhì)粒pcDNA3.1Zeo(+)進行轉(zhuǎn)染,陽性對照組即用野生型重組質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染和四個實驗組即分別用4個突變型重組質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染。細胞裂解液及細胞培養(yǎng)基LPL濃度
9、的檢測采用的是人LPLELISA試劑盒;細胞裂解液及細胞培養(yǎng)基LPL活性的檢測采用的是分光光度計法。 結(jié)果:1.通過DNA雙向測序證實,除導入的特異突變位點外無其它新的突變產(chǎn)生。突變的pcDNA3.1Zeo(+)-LPLcDNA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2.用RT-PCR法對細胞裂解液及培養(yǎng)液進行擴增,結(jié)果示:除空白及陰性對照孔未擴增出條帶外,其余各組均擴增出一條特異性條帶,其片段大小為1455bp,說明野生型及突變型重組質(zhì)粒
10、pcDNA3.1Zeo(+)-LPL基因在真核COS-1細胞中轉(zhuǎn)染成功。 3.對各組細胞裂解液及細胞培養(yǎng)基LPL濃度的檢測,結(jié)果顯示:在細胞裂解液中,野生型LPL轉(zhuǎn)染的COS-1細胞LPL濃度為298±14ng/ml,四組突變的LPL轉(zhuǎn)染的COS-1細胞LPL濃度有輕度下降趨勢,但與野生型組相比,均未達到統(tǒng)計學意義;在細胞培養(yǎng)基中,野生型LPL轉(zhuǎn)染的COS-1細胞培養(yǎng)基LPL濃度為277±7ng/ml,四組突變的LPL轉(zhuǎn)染的CO
11、S-1細胞培養(yǎng)基LPL濃度顯著下降,與野生型組相比,均達到了統(tǒng)計學意義。 4.對各組細胞裂解液及細胞培養(yǎng)基LPL活性的檢測,結(jié)果顯示:在細胞裂解液及細胞培養(yǎng)基中,野生型轉(zhuǎn)染的COS-1細胞LPL活性分別為1.69±0.03和1.47±0.02FFAumol/ml·h;相對于野生型來說,無論是細胞裂解液還是細胞培養(yǎng)基中,四組突變組的LPL活性均發(fā)生了顯著的降低,其中在Asn291Ser+Lys312insC組未檢測到LPL活性,T
12、hr361insA組LPL活性約為野生型的20%,Lys312insC組LPL活性約為野生型的12%以及Asn291Ser組LPL活性約為野生型的60%。 結(jié)論:成功地完成了LPL基因的體外定點突變;LPL的Asn291Ser、Lys312insC、Thr361insA及Asn291Ser+Lys312insC四種突變均沒有影響到LPL的轉(zhuǎn)錄和翻譯,但在不同程度上都影響到了LPL向細胞外的分泌,且都顯著降低了LPL的活性,四個突
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