左炔諾孕酮對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞體外增殖與凋亡的影響及機(jī)理研究.pdf

1、子宮肌瘤是女性生殖器官的常見(jiàn)腫瘤，其發(fā)生與細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的失衡有關(guān)。近年來(lái)，隨著對(duì)子宮肌瘤病因?qū)W研究的進(jìn)展，局部應(yīng)用孕激素類藥物的治療方法備受關(guān)注。左炔諾孕酮宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)(LNG-IUS)是當(dāng)前國(guó)際公認(rèn)性能優(yōu)良的宮內(nèi)抗生育系統(tǒng)。國(guó)外一項(xiàng)前瞻性自身對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)使用LNG-IUS能使肌瘤患者的子宮肌瘤變小，經(jīng)量減少，其對(duì)子宮肌瘤的治療作用可能與抑制內(nèi)膜生長(zhǎng)有關(guān)。然而LNG-IUS所形成的局部高效孕激素環(huán)境，是否還存在其它治療作用靶點(diǎn)和機(jī)

2、制尚不清楚。本研究首先構(gòu)建純度高、穩(wěn)定性好的人子宮平滑肌瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞，并在此基礎(chǔ)上，直接以其為作用靶標(biāo)，從增殖與凋亡的角度探討左炔諾孕酮對(duì)子宮肌瘤的作用及其相關(guān)機(jī)制。研究共分三部分： 一、人子宮平滑肌瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定采用貼塊法和酶消化法均成功獲得肌瘤細(xì)胞。采用貼塊法的第7～10d始見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞從組織塊邊緣游出，半月左右細(xì)胞長(zhǎng)滿并可傳代；應(yīng)用酶消化法時(shí)，不同肌瘤所需的消化時(shí)間稍有差異，消化所得的細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，活率可達(dá)90

3、％。光鏡下肌瘤細(xì)胞呈梭形，核橢圓形，可呈典型“峰一谷”樣生長(zhǎng)。原代與第3、9代細(xì)胞的倍增時(shí)間之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。免疫組化檢測(cè)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)95％以上。以上結(jié)果表明，貼塊法和酶消化法均能獲得大量高純度，功能良好，性狀穩(wěn)定的肌瘤細(xì)胞。 二、左炔諾孕酮對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞體外增殖與凋亡的影響MTT結(jié)果顯示，10μg/mL LNG開(kāi)始抑制肌瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，隨濃度增加及時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用加強(qiáng)；電鏡觀察20μg/mL LNG組細(xì)胞，胞質(zhì)空泡化

4、、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、線粒體固縮、染色質(zhì)濃縮邊聚；流式細(xì)胞術(shù)分析，加藥組細(xì)胞凋亡率隨LNG濃度的增加而逐漸升高；AO/EB雙染在熒光顯微鏡下觀察，對(duì)照組無(wú)明顯凋亡細(xì)胞，10μg/mL LNG組開(kāi)始出現(xiàn)早期凋亡細(xì)胞，15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL LNG組晚期凋亡細(xì)胞逐漸增多，核濃聚、偏位、被染成桔紅色，可見(jiàn)明顯的凋亡小體。這說(shuō)明，10μg/mL LNG開(kāi)始于體外發(fā)揮抑制肌瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的效應(yīng)。 三、左炔諾孕酮抑制

5、體外培養(yǎng)人子宮肌瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究RT-PCR結(jié)果顯示，10μg/mL以上LNG作用后，肌瘤細(xì)胞中IGF-I、Survivin mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.05)；Western blot證實(shí)，10μg/mL和20 μg/mL LNG作用后，Survivin蛋白表達(dá)量顯著下降，p38磷酸化水平升高，Caspase 3被明顯激活。由此可以推測(cè)，高濃度LNG對(duì)子宮肌瘤的治療機(jī)制可能與降調(diào)IGF-I表達(dá)，抑制Survivin抗凋