脂筏-神經(jīng)酰胺在TNF-α介導(dǎo)的人氣道上皮細(xì)胞NF-κB激活及雙重氧化酶DUOX-1表達(dá)中的作用.pdf

1、在基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，已經(jīng)有許多令人矚目的研究成果。隨著脂質(zhì)組學(xué)概念的提出，人們?nèi)找姘l(fā)現(xiàn)脂質(zhì)的功能并不僅僅只局限于以前所認(rèn)識(shí)到的，它們?cè)谏镱I(lǐng)域發(fā)揮的作用可能超出了人們的想象。脂筏就是一種位于細(xì)胞膜上由脂質(zhì)構(gòu)成的功能單位體。它由豐富的鞘脂、膽固醇及特定的蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)聚集而成，形成相對(duì)穩(wěn)定的具有一定功能的筏結(jié)構(gòu)漂浮于流動(dòng)的細(xì)胞膜中。當(dāng)細(xì)胞受到某種刺激時(shí)，脂筏被酸性鞘磷脂酶（ASM）激活并釋放出大量由鞘磷脂水解而來(lái)的神經(jīng)酰胺，后者迅速相

2、互聯(lián)接形成微區(qū)，這些微區(qū)又可以迅速聯(lián)結(jié)形成一個(gè)或幾個(gè)平臺(tái)區(qū)。神經(jīng)酰胺富含膜區(qū)為蛋白質(zhì)等生物活性分子之間的相互作用提供了平臺(tái)。脂筏廣泛參與了細(xì)胞的各種生物學(xué)行為，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮的作用尤為重要。支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病,與多種炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)相關(guān)，氣道上皮細(xì)胞是氣道炎癥的主要效應(yīng)細(xì)胞。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是哮喘炎癥過(guò)程中重要的啟動(dòng)因子，它可以通過(guò)激活NF-κ B誘導(dǎo)一系列炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞損傷以及氣道粘

3、液過(guò)度分泌。NF-κ B 廣泛存在于各種組織細(xì)胞，能與多種基因啟動(dòng)子上κ B 序列結(jié)合并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，通過(guò)調(diào)控許多重要的細(xì)胞因子，粘附分子，趨化因子的基因表達(dá)而參與機(jī)體的各種免疫炎癥反應(yīng)。DUOX-1是糖蛋白p91Phox的同系物，可以表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞，能夠催化其底物產(chǎn)生過(guò)氧化氫，引起細(xì)胞損傷并刺激細(xì)胞分泌大量粘液。本研究擬探討脂筏-神經(jīng)酰胺通路在TNF-α引起的NF-κ B 激活以及其下游靶基因的表達(dá)中是否發(fā)揮作用，以期為哮喘等氣道炎癥

4、性疾病的防治提供新的策略。
　　 目的：人氣道上皮細(xì)胞膜脂筏-神經(jīng)酰胺被破壞后，TNF-α刺激細(xì)胞引起的NF-κ B 激活及DUOX1表達(dá)所受到的影響。DUOX1的表達(dá)是否依賴NF-κ B的激活。
　　 方法：⑴基于ELISA的轉(zhuǎn)錄因子活性測(cè)定方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NF-κ B活性。用5ng/ml,10ng/ml,15ng/ml TNF-α分別處理人氣道上皮細(xì)胞15min,30min,60min。選取能最大程度激活NF-κ B的

5、TNF-α濃度和刺激時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞分組實(shí)驗(yàn)并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NF-κ B活性。①對(duì)照組②TNF-α刺激組：10ng/mlTNF-α處理細(xì)胞15min。③膽固醇剔除劑甲基-β-環(huán)糊精（M-β-CD）M-β-CD組：10mM M-β-CD 處理細(xì)胞30min。④MT組：M-β-CD 處理細(xì)胞后再用TNF-α刺激細(xì)胞。⑤膽固醇結(jié)合劑菲律賓菌素Ⅲ(Filipin Ⅲ)，F(xiàn)ilipin組：用6ug/ml Filipin 處理細(xì)胞1 小時(shí)。⑥FT組：用Fi

6、lipin 處理細(xì)胞后再用TNF-α刺激細(xì)胞。⑦酸性鞘磷脂酶抑制劑地昔帕明（Desipramine），Desipramine組：10 μM Desipramine 處理細(xì)胞1 小時(shí)。⑧DT組：用Desipramine 處理細(xì)胞后再用細(xì)胞因子刺激細(xì)胞。⑵Western blot檢測(cè)細(xì)胞DUOX-1的表達(dá)。細(xì)胞分組為：①對(duì)照組②TNF-α刺激組：10ng/ml TNF-α處理細(xì)胞3 小時(shí)。③M-β-CD組：10mM M-β-CD 處理細(xì)胞3

7、0min。④MT組：M βCD 處理細(xì)胞后再用TNF-α刺激細(xì)胞。⑤Desipramine組：10 μMDesipramine 處理細(xì)胞1 小時(shí)。⑥D(zhuǎn)T組：Desipramine 處理細(xì)胞后再用TNF-α刺激細(xì)胞。⑶免疫組化觀察細(xì)胞漿中DUOX-1的表達(dá)。細(xì)胞分組為：①對(duì)照組②TNF-α刺激組：10ng/ml TNF-α處理細(xì)胞3 小時(shí)。③MT組：10mM M-β-CD 處理細(xì)胞30min后再用TNF-α刺激細(xì)胞。④DT：10 μM D

8、esipramine 處理細(xì)胞1 小時(shí)細(xì)胞后再用TNF-α刺激細(xì)胞。⑷DNA decoy。細(xì)胞分組為：①對(duì)照組。②TNF-α刺激組：10ng/ml TNF-α處理細(xì)胞3 小時(shí)。③轉(zhuǎn)染試劑組：轉(zhuǎn)染試劑處理細(xì)胞過(guò)夜。④DNA轉(zhuǎn)染組：用轉(zhuǎn)染試劑將DNA 雙鏈轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)后，再用10ng/ml TNF-α處理細(xì)胞。⑸統(tǒng)計(jì)分析：?jiǎn)我蛩胤讲罘治觥?br>　　 結(jié)果：①10ng/ml TNF-α處理氣道上皮細(xì)胞15min 激活細(xì)胞內(nèi)NF-κ B 最

9、明顯（P<0.05）。脂筏干擾劑可以抑制TNF-α刺激引起的NF-κ B活性增加（P<0.05）。②TNF-α刺激細(xì)胞引起DUOX-1表達(dá)增加（P<0.05）。脂筏干擾劑可以抑制TNF-α刺激引起的DUOX-1表達(dá)增加（P<0.05）。③TNF-α刺激細(xì)胞后，在電鏡下其胞漿中DUOX-1 顆粒明顯增加。脂筏干擾劑可以抑制TNF-α刺激引起的DUOX-1 顆粒增加。④NF-κ B的DNA結(jié)合序列轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)后可以抑制 TNF-α刺激引起的