Ⅰ型脊髓性肌萎縮癥與線粒體基因組的相關(guān)性研究.pdf

1、脊髓性肌萎縮癥(spinal mUSCUlar atrophy,SMA)是一組常見(jiàn)的由于脊髓前角細(xì)胞運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化變性所導(dǎo)致的進(jìn)行性、對(duì)稱(chēng)性肢體近端和軀干肌肉無(wú)力癱瘓及萎縮為特征的遺傳性神經(jīng)肌肉疾病.SMA發(fā)病率約為1/6000,雜合子頻率高達(dá)1/50,是僅次于囊性纖維變性(cystic fibrosis,CF)的第2位常見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病.根據(jù)患者的發(fā)病時(shí)間和臨床癥狀,SMA可分為3種類(lèi)型:SMA1(OMM∶253300)、SMA

2、2(OMIM∶253550)和SMA3(OMM∶253400).其中SMA1為致命性,是位居世界兒童死亡率第一位的"殺手".患者通常在出生后6個(gè)月左右發(fā)病,不能坐和行走,多于2歲之內(nèi)因呼吸衰竭而死亡.目前,尚無(wú)緩解和治療SMA的措施. 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因(survival ofmotor neuron,SMN)為SMA的主要致病基因.人SMN定位于5q12.2-q13.3,全長(zhǎng)500kb,包括9個(gè)外顯子.SMN有2個(gè)非常相似的拷

3、貝,根據(jù)所處位置的不同,分別為端粒區(qū)拷貝:SMN1;中心粒區(qū)拷貝:SMN2.人SMN1和SMN2基因可能是進(jìn)化過(guò)程中通過(guò)基因轉(zhuǎn)換形成的倒位重復(fù)DNA序列.少數(shù)正常個(gè)體可能由于基因轉(zhuǎn)換而缺失SMN2,僅具有SMN1. 約90﹪～98﹪的SMA患者可能具有SMN1第7外顯子的同源缺失或截?cái)?這可以作為SMA基因診斷的理論基礎(chǔ). 國(guó)外曾有報(bào)道,對(duì)于脊髓前角細(xì)胞運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化引起的肌肉萎縮,線粒體DNA(mitochondria

4、l DNA,mtDNA)缺失可能為其次要因素.在一些具備SMA臨床癥狀但是SMN基因無(wú)突變?nèi)笔У幕颊咧?肌肉組織活檢發(fā)現(xiàn)線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活動(dòng)減少,同時(shí)細(xì)胞色素C氧化酶(eytochrome c oxidase,COX)和/或胸苷激酶2(thymidine kinase 2,IK2)發(fā)生突變.在一些散發(fā)性SMAl患者中,發(fā)現(xiàn)存在細(xì)胞色素C氧化酶的合成(the synthesis of cytochrome oxidase 2,SCO2

5、)突變.關(guān)于SMAl的線粒體DNA突變信息國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少,對(duì)結(jié)論尚有爭(zhēng)議. 研究目的： 對(duì)漢族疑似SMA1患者的線粒體基因組全序列進(jìn)行測(cè)序分析,以期探討與SMA1發(fā)病相關(guān)的線粒體因素. 研究對(duì)象： 32例散發(fā)性漢族疑似SMAl患者和50例正常健康對(duì)照. 研究方法(1)抽取患者和正常健康對(duì)照的外周血(抗凝),苯酚.氯仿法純化基因組DNA.(2)運(yùn)用錯(cuò)配聚合酶鏈反應(yīng).限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方

6、法從基因角度進(jìn)一步對(duì)疑似SMAl患者確診.(3)隨機(jī)篩選10例患者及10例正常健康對(duì)照,PCR擴(kuò)增其mtDNA全序列,應(yīng)用通用引物M13進(jìn)行正、反向測(cè)序.(4)DNAssist軟件進(jìn)行mtDNA數(shù)據(jù)分析. 研究結(jié)果： (1)在32例散發(fā)性漢族疑似SMAl患者中,SMN1第7外顯子的缺失突變率為96.9﹪(31/32). (2)在9例隨機(jī)篩選的存在SMNl第7外顯子缺失突變的SMAl患者及1例無(wú)SMNl第7外顯子缺

7、失突變的患者線粒體全基因組序列中發(fā)現(xiàn)5個(gè)一致性突變:73A>G、263A>G、10398A>G(Thr-Ala)、10400C>T、16223C>T.其中,10398A>G位于ND3基因;73A>G、263A>G、16223C>T屬于mtDNA高突變區(qū);10400C>T為同義突變(synonymous mutation). 結(jié)論： (1)10398A>G(Thr-Ala)/ND3突變可能與SMAl的發(fā)生有關(guān). (

8、2)ND3為NADH的一個(gè)亞基,而NADH從屬于線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體I(mitochondrial respiratory complex I).大部分代謝物脫下2H由氧化型NAD<'+>接受,形成還原型NADH.然后呼吸鏈酶復(fù)合體I負(fù)責(zé)將還原型NADH中的2H傳遞給泛醌(ubiquinone).ND3在線粒體呼吸鏈中起著重要的輔助電子傳遞和氧化磷酸化作用.可以推測(cè),所發(fā)現(xiàn)的突變:10398A>G(Thr-Ala)/ND3影響了呼吸鏈酶

9、復(fù)合體I的功能,導(dǎo)致線粒體呼吸鏈出現(xiàn)異常,從而使SMAl患者出現(xiàn)肌無(wú)力、肌肉萎縮等臨床癥狀.而73A>G、263A>G、16223C>T位于mtDNA的控制區(qū)(control region,CR)即非編碼區(qū),屬于多態(tài)性位點(diǎn),通常被認(rèn)為是非功能性單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP).但在我們所研究的10例散發(fā)性漢族SMAl患者中同時(shí)出現(xiàn)上述4個(gè)一致性突變,表明其在SMAl的發(fā)病中(如進(jìn)行性