線粒體基因組與高原習(xí)服適應(yīng)相關(guān)性的初步研究.pdf

1、高原環(huán)境影響機體的主要因素是缺氧，機體對高原環(huán)境的習(xí)服適應(yīng)也主要是圍繞著氧的攝取-運輸-利用這條軸線來進(jìn)行的。線粒體是機體能量代謝的中心，是組織、細(xì)胞氧利用的關(guān)鍵場所，機體耗能的90％以上來自于線粒體的氧化磷酸化作用。因此，線粒體作為細(xì)胞的“動力工廠”，在低氧引起細(xì)胞損傷和組織、細(xì)胞對低氧環(huán)境的習(xí)服過程中的作用都是至關(guān)重要的。以往的研究發(fā)現(xiàn)急性缺氧可以抑制線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的轉(zhuǎn)錄和翻譯，損害線

2、粒體的功能，而慢性缺氧時線粒體的功能得到一定程度的恢復(fù)，這種線粒體的功能改變是機體低氧習(xí)服適應(yīng)的一個重要機制，線粒體的功能改變受到線粒體基因的表達(dá)變化、線粒體基因組序列和數(shù)目變化的影響。 高原世居藏族是目前公認(rèn)的對高原低氧環(huán)境適應(yīng)最好的民族，有關(guān)高原世居藏族低氧適應(yīng)的機制目前還不清楚。高原世居藏族已建立了完善的母體--胎盤--胎兒系統(tǒng)及適應(yīng)低氧的胎盤機制，因而采用基因芯片技術(shù)對高原世居藏族胎盤組織線粒體功能相關(guān)基因的表達(dá)譜變化進(jìn)

3、行深入研究，有助于我們探討線粒體基因組在高原適應(yīng)中的機制。 線粒體功能相關(guān)基因表達(dá)譜發(fā)生了變化可能是由于線粒體基因組變化所致。高原鼠兔(ochotona curzoniae)是目前研究高原習(xí)服適應(yīng)的理想動物模型之一，高原鼠兔在長期的低氧和寒冷環(huán)境中可能通過提高線粒體基因組的進(jìn)化速度和改變OXPHOS的效率獲得高原適應(yīng)，對于高原鼠兔的mtDNA的全長序列缺少報道，對高原鼠兔線粒體基因組與高原適應(yīng)機制尚無研究。因而采用PCR-測序的

4、方法測定高原鼠兔的線粒體基因組及研究該基因組與高原適應(yīng)的關(guān)系。 線粒體是半自主細(xì)胞器，其功能由線粒體基因組和核基因組共同決定。與核DNA(nuclear DNA，nDNA)相比，mtDNA突變率較高，在這些突變中有的突變?yōu)橹行酝蛔?，這種中性突變逐漸累積就形成單倍群(haplogroup)和單倍型(haplotype)。一些線粒體的單倍群或單倍型能夠影響線粒體的功能，例如使ATP和ROS的生成發(fā)生改變，因而研究人線粒體單倍群、單倍

5、型與高原習(xí)服適應(yīng)以及高原習(xí)服不良的疾病(高原肺水腫)的關(guān)系，為深入研究高原習(xí)服適應(yīng)的線粒體遺傳機制打下基礎(chǔ)。 本研究中首先通過對26例漢族個體的mtDNA全長進(jìn)行測序，序列進(jìn)行比對分析，尋找出漢族人mtDNA多態(tài)性的特征(SNPs或單倍群)；然后采用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶多態(tài)性(poJymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RF

6、LP)、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng).高溫連接酶反應(yīng)(polymerase chain reaction-ligasedetection reaction，PCR-LDR)的方法分別研究漢族人線粒體的單倍群和單倍型與高原適應(yīng)以及高原習(xí)服不良的疾病(高原肺水腫)的易感性之間的關(guān)系。 線粒體基因組的變化處序列變化外還有數(shù)目變化，線粒體呼吸鏈氧化磷酸化不但與mtDNA結(jié)構(gòu)的完整性相關(guān)還與其拷貝數(shù)相關(guān)，mtDNA拷貝數(shù)增加被認(rèn)為是總線粒體呼吸功能的代

7、償。對于mtDNA拷貝數(shù)在高原習(xí)服適應(yīng)中變化規(guī)律，目前尚不清楚。采用定量PCR的方法研究線粒體基因組數(shù)目多態(tài)性與高原習(xí)服適應(yīng)的關(guān)系。 我們?nèi)〉玫闹饕Y(jié)果有： 1.高原世居藏族與移居漢族相比，有24個基因的表達(dá)存在差異，其中表達(dá)上調(diào)的基因3個，表達(dá)下調(diào)的基因21個。這些差異表達(dá)基因編碼蛋白的功能涉及能量代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、電子鏈傳遞、DNA損傷與修復(fù)、細(xì)胞粘附分子等方面。通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)Kdr、Dctn2以及C

8、ox17基因的mRNA表達(dá)與基因芯片結(jié)果同趨勢。 2.高原鼠兔mtDNA的全長為17，131 bp(No.EF535828)，與其它哺乳動物的mtDNA序列相似，含13種編碼蛋白質(zhì)、22個tRNA和2個rRNA。除ND6和8個tRNA基因(Gin-tRNA、Ser-tRNA、Ala-tRNA、sn-tRNA、Cys-tRNA、Tyr-tRNA、Glu-tRNA以及Pro-tRNA)位于輕鏈上，其余基因位于重鏈上。該序列堿基A占3

9、1.02％，堿基T占29.65％，堿基C占13.46％，堿基G占25.87％。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)高原鼠兔與美洲鼠兔的遺傳距離最近，其次是與家兔的遺傳距離較近；通過對高原鼠兔的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，高原鼠兔的COX1、COX2基因的氨基酸序列發(fā)生了改變。 3.高原世居藏族中單倍群D4的頻率(4.5％)非常顯著低于平原漢族(20.0％，P<0.005)和移居漢族(16.4％，P<0.05)，單倍型nt3010G-nt3970C在高原世居藏族

10、中的頻率(84.8％)非常顯著高于平原漢族(51.4％，P<0.005)和移居漢族(63.3％，P<0.005)。單倍群D4和單倍型nt3010G-nt3970C的頻率在平原漢族和移居漢族中沒有差別。 4.HAPE病例組單倍群D4的頻率(14.2％)顯著低于對照組(22.9％，P=0.033。OR=0.555，95％CI：0.327-0.942)；HAPE病例組單倍群B的頻率(21.6％)顯著高于對照組(11.5％，P=0.01

11、3，OR=2.118，95％CI:1.194-3.756)；在單倍群R9中HAPE病例組mtDNA等位基因nt13497G頻率(19.4％)高于對照組(0％，P<0.05)；HAPE病例組單倍型nt3970C-nt13497G的頻率(15.6％)非常顯著高于對照組(0％，P<0.005)。 5.缺氧sD大g(450.m，30天)肝臟mtDNA拷貝數(shù)(2081.86±435.6060)非常顯著高于高原鼠兔(51.72±13.697

12、7，P<0.005)和平原對照SD大鼠(49.13±17.0393，P<0.005)。 6.在高原習(xí)服過程中mtDNA拷貝數(shù)增加，對于獲得高原適應(yīng)高原世居藏族人，mtDNA拷貝數(shù)又逐漸降低。HAPE病人mtDNA拷貝數(shù)低可能是HAPE的發(fā)病原因和遺傳標(biāo)記。 7.移居漢族的mtDNA拷貝數(shù)(0.1238±0.0180)顯著高于平原漢族(0.0822±0.0094，P<0.05)；HAPE病人的mtDNA拷貝數(shù)(0.0291

13、±0.0055)非常顯著低于平原漢族(0.0822±0.0094，P<0.005)、移居漢族(0.1238±0.0180，P<0.005)和高原世居藏族(0.0847±0.0128，P<0.005)。 通過上述研究我們可以得到以下結(jié)論： 1.線粒體基因的表達(dá)變化可能改變線粒體COXI-COXIV的活性而影響ATP的生成，參與高原適應(yīng)。 2.高原鼠兔mtDNA序列的改變可能是其高原適應(yīng)的重要機制。 3.首次

14、報道了漢族人mtDNA9個SNPs位點。 4.單倍群D4與世居藏族高原適應(yīng)呈負(fù)相關(guān)，單倍型nt3010G-nt3970C與世居藏族高原適應(yīng)呈正相關(guān)。 5.單倍群D4為HAPE的保護(hù)因素，單倍群B和單倍型nt3970C-nt13497G為HAPE的危險因素。 6.在高原習(xí)服過程中mtDNA拷貝數(shù)增加，獲得高原適應(yīng)后mtDNA的拷貝數(shù)又降低。 7.HAPE病人mtDNA拷貝數(shù)低可能是其發(fā)病的重要遺傳機制。