丙型肝炎病毒基因組變異與肝細(xì)胞癌的相關(guān)性研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)是引起慢性肝炎、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)等慢性肝病的主要病原體之一。HCV感染呈全球性流行,據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),目前世界上感染率約為3％,全球估計(jì)有超過1.7億的慢性HCV感染者,每年新發(fā)病例約350萬例,是歐美及日本等已發(fā)展國家中晚期肝病的主要原因之一。我國HCV發(fā)病情況也呈逐年上升趨勢。HCV感染已成為世界性的最重要的公共

2、健康問題。臨床上,HCV感染有兩個(gè)顯著特點(diǎn),其一為高度的慢性化,急性感染者中有50％-80％發(fā)展為慢性肝炎；其二為廣泛的疾病譜,多數(shù)患者只表現(xiàn)為輕微的肝損傷,而有大約20％的病人會(huì)發(fā)展為肝硬化,其中30％-50％的肝硬化患者最終可能會(huì)發(fā)展為HCC。
　　 HCV為有包膜的單股正鏈RNA病毒,在分類學(xué)上屬于黃病毒科(Flaviviridae),丙型肝炎病毒屬。其RNA基因組全長約9.4-9.6 kb。由三個(gè)連續(xù)部分組成:5’端的非

3、翻譯區(qū)(5’-untranslated regions,5’UTR)、單一的大開放閱讀框(open reading frame,ORF)和3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)。而ORF編碼一大小約3010-3033個(gè)氨基酸的多蛋白前體。基因組高度變異是HCV的一個(gè)基本生物學(xué)特性。依據(jù)其核酸序列的相似性,HCV至少可分為6個(gè)基因型和100多個(gè)基因亞型。并且在單一病毒株感染患者體內(nèi)形成準(zhǔn)種結(jié)構(gòu)。病毒的變異與其致病性經(jīng)常是密切相關(guān)的,例如人類乳突病毒

4、有130個(gè)型別,但與子宮頸癌相關(guān)的主要是16與18型。是以自HCV發(fā)現(xiàn)以來,其病毒變異與疾病的相關(guān)性,特別是與HCC的相關(guān)性,一直是HCV研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。但到目前為止,仍沒有一個(gè)明確的結(jié)論。這主要與下列因素有關(guān)。一是許多研究的樣本數(shù)太小,所導(dǎo)致的結(jié)論不具備實(shí)質(zhì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；二是HCC本身是一個(gè)多因素作用的結(jié)果,在研究病毒變異的作用時(shí),其他因素沒有能夠很好地控制；三是檢測病毒變異的方法不一,有些研究使用凝膠阻滯分析,使得各研究之間的數(shù)

5、據(jù)闡釋存在困難。
　　 鑒于上述因素,在探求HCV基因變異與HCC相關(guān)性的大前提下,本課題在研究上設(shè)計(jì)了包含三個(gè)相對(duì)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn),即(1)3’UTR變異與HCC的相關(guān)性；(2)在縱向分子流行病學(xué)框架下HCV株以及核心區(qū)基因變異與HCC的相關(guān)性；(3)在轉(zhuǎn)基因鼠模型上觀察HCV Core變異對(duì)HCC的誘導(dǎo)作用。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一方面彌補(bǔ)了以往同類研究的遺漏與不足,另一方面對(duì)HCC的致癌過程提供了新的闡釋。同時(shí),實(shí)驗(yàn)中所建立的分子生物學(xué)

6、技術(shù)及基因分析流程對(duì)HCV研究,乃至對(duì)其他RNA病毒研究,具有重要的方法學(xué)意義。
　　 試驗(yàn)?zāi)康?通過從病人血清中直接測定HCV完整的3’UTR,檢測HCV3’UTR的變異與HCC的相關(guān)性。
　　 試驗(yàn)方法:
　　 1.建立從病人血清中直接測定HCV完整3’UTR的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案。
　　 2.將此方案直接用于HCC及對(duì)照組病人HCV3’UTR的檢測。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析HCV3’UTR是否存在

7、變異及其與HCC的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:
　　 1.評(píng)估了5個(gè)DNA聚合酶從HCVcDNA質(zhì)粒中擴(kuò)增3’UTR poly(T／TG)結(jié)構(gòu)域的能力。其中聚合酶rTth XL、AmpliTaq和DyNAzyme可以用于隨后的優(yōu)化RT-PCR方案。
　　 2.用部分重疊法設(shè)定RT-PCR的引物區(qū)域,以避免由于病毒3’UTR高度結(jié)構(gòu)所導(dǎo)致的DNA聚合酶的滑翔效應(yīng)。
　　 3.優(yōu)化快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)方

8、法以測定HCV完整3’UTR的極尾區(qū)域。
　　 4.優(yōu)化方案:兩步法測定完整的HCV完整3’UTR。從NS5B到3'X結(jié)構(gòu)的中央部分作為第1個(gè)區(qū)域用RT-PCR擴(kuò)增檢測,包含3'X結(jié)構(gòu)的第二個(gè)區(qū)域用RACE方法檢測。
　　 5.直接用于測定HCC及對(duì)照組病人(各20例)埃及HCV4a基因型3'UTR,統(tǒng)計(jì)分析未發(fā)現(xiàn)3’UTR變異與HCC之間存在相關(guān)性.
　　 結(jié)論:
　　 1、建立了直接從病人微量血清測定

9、全長HCV3’UTR的方法,這一方法不僅對(duì)HCV研究具有相當(dāng)?shù)闹匾?對(duì)其他用常規(guī)方法不能測定3’UTR的RNA模板,具有普遍的適用性。
　　 2、HCV3’UTR變異主要體現(xiàn)在其均聚區(qū)的長度變化而不是核苷酸組成成分的改變,與我們通常所說的基因變異概念上有很大差別。
　　 3、埃及流行的HCV4a3’UTR同樣呈現(xiàn)長度變異,但此變異與HCC的發(fā)生之間無相關(guān)性存在。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?探討埃及流行的HCV4a基因型中

10、是否存在與HCC相關(guān)的變異位點(diǎn)或特異性病毒株。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.數(shù)據(jù)收集:應(yīng)用具有明確采樣模式和日期的三組HCV序列數(shù)據(jù),包括健康攜帶者、肝硬化和HCC患者。
　　 2.針對(duì)這三組數(shù)據(jù)的重疊區(qū)域,即丙型肝炎約387-bp處的Core(Core)及第一膜區(qū)基因(E1)區(qū)域,應(yīng)用分子進(jìn)化遺傳分析軟件包(MEGA)分析其基因變異頻率,變異模式及與HCC的相關(guān)性。
　　 3.分析以疾病為基礎(chǔ)的病毒群體

11、進(jìn)化壓力及趨勢。
　　 結(jié)果:
　　 1.應(yīng)用不同引物擴(kuò)增HCVCore／E1區(qū)域,不導(dǎo)致顯著的序列錯(cuò)誤。
　　 2.異質(zhì)性模板能夠誘發(fā)DNA聚合酶的擴(kuò)增錯(cuò)誤。
　　 3.埃及流行的HCV4a基因型中無時(shí)間或疾病依賴的特異性HCV變異或病毒株的存在。
　　 結(jié)論:
　　 1、無論是在HCC還是在肝硬化的形成過程中,埃及流行的HCV4a Core／E1區(qū)中不存在特異性病毒變異位點(diǎn),同時(shí),以該

12、區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)的種系分析未揭示HCC特異性病毒株的存在。
　　 2、HCV4a在埃及有長期的進(jìn)化史且目前仍然處于進(jìn)化活躍期。
　　 3、異質(zhì)性模板所誘發(fā)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)錯(cuò)誤與終末期肝病患者丙型肝炎病毒所承受的強(qiáng)大進(jìn)化壓力可導(dǎo)致偏離數(shù)據(jù)的產(chǎn)生與解讀。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?構(gòu)建HCV Core轉(zhuǎn)基因小鼠模型,探討Core變異對(duì)HCV致癌潛能的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.直接從HCC及肝硬化病人中

13、克隆HCV Core,通過基因分析確定轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)所需的病毒株。
　　 2.目標(biāo)Core的核苷酸編碼優(yōu)化及人工合成。
　　 3.轉(zhuǎn)基因片段裝配,引入人脂蛋白調(diào)控序列。
　　 4.轉(zhuǎn)基因片段顯微注射產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　 5.追蹤觀察。
　　 結(jié)果:
　　 1.結(jié)合臨床病例特征基因分析結(jié)果,選取病人H和病人P21的HCV Core成功構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　 2.追蹤觀察實(shí)驗(yàn)組H及P21