線粒體基因組D環(huán)區(qū)基因突變與甲狀腺腫瘤的相關性研究.pdf

1、目的： 1.確定與甲狀腺腫瘤相關的mtDNA D環(huán)區(qū)基因突變位點。 2.明確患有不同類型甲狀腺腫瘤患者mtDNA的突變率、突變類型與腫瘤進展的關系。 方法： 1.根據病理診斷結果，選取于溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院就診的甲狀腺腫瘤患者101例，包括甲狀腺惡性腫瘤(甲狀腺乳頭狀癌)77例、甲狀腺良性腫瘤(甲狀腺濾泡型腺瘤)5例、甲狀腺良性增生(結節(jié)性甲狀腺腫)19例。所有患者均無血緣關系，男女比例約1：3，惡性腫

2、瘤組平均年齡為47.675±12.86，良性腫瘤組平均年齡為41±6.60，良性增生組平均年齡為48.684±13.17。收集所有患者經HE染色的5μm厚手術冰凍切片2張和相匹配的患者外周血，所有外周血和組織的采集均為患者未經任何藥物治療或放化療之前。 2.由病理科醫(yī)生對所有經HE染色的冰凍切片在顯微鏡下(×40)對其觀察，尋找腫瘤細胞數量大于70％的區(qū)域標記為腫瘤組織區(qū)[1]，用1ml注射器針頭分離剝取腫瘤組織和腫瘤旁正常組織

3、。 3.提取所有標本的腫瘤組織、腫瘤旁正常組織和血液的全基因組DNA，通過PCR方法擴增其mtDNA D環(huán)區(qū)基因，直接測序后分析其基因序列。 4.通過統(tǒng)計學方法，結合患者臨床資料分析不同類型、不同性別、不同臨床生化指標對甲狀腺腫瘤患者mtDNA D環(huán)區(qū)基因的突變差異。 結果： 1.在77例甲狀腺惡性腫瘤(甲狀腺乳頭狀癌)患者、5例甲狀腺良性腫瘤(甲狀腺濾泡型腺瘤)患者、19例甲狀腺良性增生(結節(jié)性甲狀腺腫

4、)患者中檢測到mtDNA D環(huán)區(qū)的突變率分別為16.88％，0和15.79％。 2.6例患者攜帶mtDNA D環(huán)區(qū)點突變，包括5例甲狀腺惡性腫瘤患者以及1例良性增生患者。所有mtDNA點突變患者中除1例出現(xiàn)A-T顛換外，其余均為A-G或C-T轉換。3例惡性腫瘤患者分別在16093、16145、16258和16292位點發(fā)生異質性突變。1例甲狀腺良性增生患者在16189位點同時存在T/C堿基，形成了polyC長度的不穩(wěn)定性。

5、 3.在77例甲狀腺惡性腫瘤(甲狀腺乳頭狀癌)、5例甲狀腺腺良性腫瘤(甲狀腺濾泡型腺瘤)、19例甲狀腺良性增生(結節(jié)性甲狀腺腫)中檢測到分別為8例(10.39％)，0例和2例(10.53％)的線粒體微衛(wèi)星不穩(wěn)性(mtMSI)。本研究只有1例標本的mtMSI為523：524位點的AC插入，其余均位于D310區(qū)域。 4. mtDNA D環(huán)區(qū)突變與甲狀腺腫瘤患者性別、年齡、是否有家族史、腫瘤大小、以及甲狀腺五項功能檢測數據(甲狀腺素

6、、三碘甲狀腺氨酸、促甲狀腺素、游離甲狀腺素、游離三碘甲狀腺原氨酸)均無相關性。 結論： 1. mtDNA D環(huán)區(qū)是線粒體DNA突變的熱點區(qū)域，不同的腫瘤有不同的突變頻率。以現(xiàn)有的研究結果看，mtDNA D環(huán)區(qū)突變雖然不能作為甲狀腺惡性腫瘤的標志，但從本研究看，至少其可能參與甲狀腺腫瘤的早期發(fā)生。 2. mtDNA同質性突變是由于含有mtDNA突變細胞具有選擇性生長優(yōu)勢，在腫瘤細胞增殖過程中逐漸在數量上占優(yōu)，同樣可

7、推測：同一線粒體中，突變基因相對正?；蚓哂袕椭苾?yōu)勢；同一細胞中，突變線粒體相對正常線粒體具有增殖優(yōu)勢。因此，突變基因有大量復制的潛能。 3. D環(huán)區(qū)的突變可能因而引起整個線粒體功能的紊亂，抑制呼吸鏈的電子傳遞，阻礙對于細胞能量的供應，并且產生大量的ROS，而甲狀腺是一個能量需求的器官，只有過度復制使之從數量上增加才能補償線粒體的功能缺陷，而ROS可能作為腫瘤產生的誘發(fā)劑或啟動劑以促進細胞進行分化，從而產生癌變。從而使得攜帶這些

8、突變的個體更容易受到線粒體功能的缺陷，從而引起腫瘤。 4.相比與D環(huán)區(qū)其他區(qū)域的mtMSI，D310區(qū)域的突變是甲狀腺腫瘤的突變熱點。 5. mtMSI可能是負責DNA合成的γ聚合酶在4個以上連續(xù)核苷酸處的保真性較低的緣故，也可能是由于腫瘤細胞不斷的分裂導致含有polyC結構的D310區(qū)域比正常細胞更易產生復制滑移。 6.初步提示mtDNA D環(huán)區(qū)突變與甲狀腺腫瘤患者性別、年齡、是否有家族史、腫瘤大小、以及甲狀腺