線粒體DNA ATPase 6，8基因突變與大鼠酒精性肝病發(fā)生發(fā)展的相關性研究.pdf

1、背景：酒精性肝病是由于長期大量飲酒引起的肝臟病變，在西方國家較多見。近年來隨著我國人民生活水平的提高和飲食結構的改變，酒精性肝病的發(fā)病率在我國呈明顯的上升趨勢。過量飲酒不僅可引起酒精性肝病，而且還會導致一系列社會和心理問題。根據(jù)病情和病程，酒精性肝病可分為輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化等階段。自從Addsion和Rokitansky分別于1836年和1849年報道了酒精與肝臟脂肪代謝的關系，初步提

2、出了酒精性肝病(ALD)的概念以后，國內(nèi)外眾多學者對酒精性肝病的發(fā)病機制從許多方面進行了深入的研究，大致包括：化學反應與藥理學機制；細胞因子和免疫學及病毒學機制；遺傳學機制；營養(yǎng)學機制等。 過量飲酒可使線粒體的呼吸鏈功能亢進而促使誘生活性氧，活性氧又可損傷線粒體DNA(mtDNA)而引起堿基序列改變，蓄積的異常線粒體DNA可因呼吸鏈功能障礙而致活性氧溢出增多，導致基因突變和發(fā)生凋亡<'[1]>。 現(xiàn)在，越來越多的證據(jù)表明

3、線粒體是氧化應激引起的細胞凋亡的重要通路。線粒體是細胞的能量庫。正常情況下，機體通過線粒體電子傳遞鏈產(chǎn)生ATP提供機體所需的能量。 線粒體DNA(mtDNA)是存在于細胞內(nèi)的、除細胞核DNA(nDNA)外的唯一遺傳物質。近年來線粒體DNA突變與某些疾病的關系研究進展迅速，備受人們的關注。但線粒體DNA突變引起的線粒體呼吸鏈功能異常、細胞內(nèi)ATP產(chǎn)生異常是否與酒精性肝病的發(fā)生有著直接的關系 未見報道。目的：從基因水平、細胞器水平

4、對線粒體DNA ATP酶6，8基因突變與酒精性肝病發(fā)生發(fā)展之間的關系進行探討，從一個新的角度對酒精性肝病的發(fā)病機制進行有益的研究，以期揭示線粒體DNA突變可能導致的細胞能量代謝障礙以及由此引起的細胞內(nèi)脂質代謝紊亂、細胞壞死或凋亡與酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展之間的關系，為臨床防治酒精性肝病提供實驗依據(jù)。 材料與方法 首先應用酒精灌胃加橄欖油平衡飲食的建模方式，分別建立大鼠酒精性脂肪肝組、酒精性肝炎和酒精性肝纖維化組動物模型，并設對照組，

5、進行肝臟組織學觀察。造模成功后，分別留取各組動物血液、肝臟標本，迅速液氮冷凍后轉入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。PCR擴增線粒體DNAATPase 6,8基因，PCR產(chǎn)物純化、檢測后，送Invitrogen上海英駿生物技術有限公司進行序列測定。然后與NCBI blast網(wǎng)站提供的ATPase 6,8基因序列核對，判定有無基因突變及突變類型。以生物發(fā)光法分別測定三組肝組織中ATP含量，判定ATPase 6,8基因突變對肝細胞內(nèi)ATP能量合成的影響

6、，以及由此可能引起的肝細胞脂質代謝障礙、脂質儲積，引發(fā)酒精性肝病。 結果： 經(jīng)光鏡和電鏡觀察證實，本研究成功建立起大鼠酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝纖維化三個不同病理階段的動物模型。經(jīng)PCR擴增三個模型組肝細胞線粒體：DNA ATPase 6,8亞基基因并測序后發(fā)現(xiàn)，A17Pase 6亞基基因發(fā)生2處突變，即T8151C和C8300T，且突變檢出率隨造摸時間延長和病程進展而明顯提高，對照組未檢出突變。大鼠肝細胞內(nèi)ATP含量隨

7、造摸時間延長和病變進展而明顯降低。提示線粒體DNA ATPase 6,8亞基基因突變與酒精性肝病的發(fā)生有著密切的關系。 結論 1．本研究采用橄欖油平衡飲食加酒精灌胃的方法成功建立了酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝纖維化的大鼠模型。該造模方法簡便、費用適中，模型穩(wěn)定，是研究酒精性肝病的理想動物模型。 2．造模早期肝細胞線粒體便出現(xiàn)形態(tài)學的改變，提示酒精對線粒體的損傷進而影響了線粒體的功能，可能為酒精性肝病發(fā)生的重

8、要機制之一。 3．在酒精性肝病大鼠肝細胞線粒體DNA ATPase 6亞基基因發(fā)現(xiàn)兩處基因突變，即T8151C和C8300T，均為點突變；基因突變檢出率隨造模時間的延長和酒精性肝病病變的加重而明顯增高，提示持續(xù)過量的酒精攝入可造成肝細胞線粒體DNA ATPase6亞基基因突變，而后者可能參與了酒精性肝病的發(fā)生與發(fā)展。 4．酒精性肝病大鼠肝細胞內(nèi)ATP含量隨造模時間延長和酒精性肝病病變的加重而明顯降低，提示肝細胞線粒體