鹽酸度洛西汀對P-糖蛋白功能影響的體內(nèi)外結(jié)合研究.pdf

1、一、目的： 通過考察鹽酸度洛西汀對Caco-2細(xì)胞上P-糖蛋白功能和表達(dá)的影響以及對P-糖蛋白底物他林洛爾人體藥動學(xué)的影響，探討鹽酸度洛西汀對P-糖蛋白的作用。 二、方法： （一）鹽酸度洛西汀對Caco-2細(xì)胞上P-糖蛋白功能和表達(dá)的影響 1.細(xì)胞培養(yǎng)以及形態(tài)學(xué)驗證 用MEM培養(yǎng)基對Caco-2細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，建立Caco-2細(xì)胞模型，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行P-糖蛋白表達(dá)驗證。 2.細(xì)胞毒性試驗

2、 用MTT法考察鹽酸度洛西汀對Caco-2細(xì)胞的毒性，選擇細(xì)胞存活率大于90％的藥物濃度作為最大無毒濃度進(jìn)行下一步細(xì)胞試驗。 3.羅丹明-123外排試驗 用維拉帕米作為P-糖蛋白功能抑制的陽性對照，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)羅丹明-123的熒光強(qiáng)度，考察度洛西汀對P-糖蛋白介導(dǎo)的羅丹明-123外排作用的影響，從而判斷藥物對P-糖蛋白功能的影響。 4.P-糖蛋白表達(dá)的測定 藥物與細(xì)胞作用72h后采用流式

3、細(xì)胞術(shù)分析度洛西汀對Caco-2細(xì)胞上P-糖蛋白表達(dá)的影響。 （二）鹽酸度洛西汀對他林洛爾人體藥動學(xué)的影響 1.給藥方法 采用隨機(jī)開放，兩周期自身前后對照試驗設(shè)計，12名健康受試者第一周期單劑量口服他林洛爾1片（50mg），第二周期受試者服用度洛西?。?0mg/次，Bid），連續(xù)服用6天，于第七天晨加服他林洛爾1片（50mg）。洗脫期：1周。 2.血樣采集方法 在他林洛爾服藥前及服藥后0.5，1.

4、1.5，2，3，4，5，6，7，9，12，24，36，48和60h由肘靜脈取血5mL置肝素化離心管中，分離出血漿，置-70℃冰箱中保存待測。 3.測定方法 采用HPLC-ESI-MS/MS法測定血漿中他林洛爾的濃度。 三、結(jié)果： （一）鹽酸度洛西汀對P-糖蛋白作用的研究結(jié)果 1.細(xì)胞培養(yǎng)以及形態(tài)學(xué)驗證 Caco-2形態(tài)正常；流式細(xì)胞儀測定顯示Caco-2細(xì)胞高度表達(dá)P-糖蛋白，適合用于鹽

5、酸度洛西汀對P-糖蛋白功能和表達(dá)影響的研究。 2.細(xì)胞毒性試驗 鹽酸度洛西汀在（）10μmol/L時，與細(xì)胞培養(yǎng)72h后細(xì)胞的存活率大于90％，因此，鹽酸度洛西汀的最大無毒濃度為10μmol/L。 3.鹽酸度洛西汀對羅丹明-123外排的影響 與陰性對照組相比，低、中、高濃度（0.2、5、10μmol/L）的鹽酸度洛西汀顯著降低了羅丹明-123從Caco-2細(xì)胞的外排（p<0.05），但不同藥物處理組間差別

6、不明顯。 4.鹽酸度洛西汀對P-糖蛋白表達(dá)的影響 Caco-2細(xì)胞與低、中、高濃度（0.2、5、10μmol/L）的鹽酸度洛西汀培養(yǎng)72h后，其熒光強(qiáng)度與陰性對照組相比，沒有顯著性差異。說明試驗濃度的鹽酸度洛西汀對P-糖蛋白的表達(dá)無明顯作用。 （二）鹽酸度洛西汀對他林洛爾人體藥動學(xué)的影響 1.他林洛爾的測定 他林洛爾在2.0～240.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。萃取回收率均大于86.6

7、％，方法回收率為94.3％～105.6％，日內(nèi)、日間RSD均小于13％，穩(wěn)定性試驗RSD均小于10.5％。 2.鹽酸度洛西汀對他林洛爾藥動學(xué)的影響 受試者多劑量服用鹽酸度洛西汀后，他林洛爾的AUC0-60和Cmax由單用時的1348.54 ng·h/mL，91.90 ng/mL分別增加至1498.30ng·h/mL和125.21 ng/mL。AUC和Cmax分別增加了11％和36％。等效性分析顯示兩周期AUC和Cmax比

8、值的90％置信區(qū)間分別為77％-106％和68％-112％，均落于等效范圍之外。他林洛爾的其它藥動學(xué)參數(shù)Tmax，t1/2，CL/F，V/F在兩周期間并無顯著性差異。 四、結(jié)論： 本試驗首次從體內(nèi)、體外兩方面考察了鹽酸度洛西汀對P-糖蛋白功能的影響。體外試驗顯示：低、中、高濃度（0.2、5、10μmol/L）的鹽酸度洛西汀均抑制了P-糖蛋白的功能，降低了羅丹明-123從Caco-2細(xì)胞中的外排，但是共同培養(yǎng)72h并不影響

9、P-糖蛋白的表達(dá)。這說明鹽酸度洛西汀對P-糖蛋白的影響僅為功能上的抑制，其抑制的可能原因為競爭性抑制，或者抑制ATP酶等，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。體內(nèi)試驗顯示：多劑量服用度洛西汀使得他林洛爾的AUC和Cmax增加，提高其生物利用度，但并不影響其他的藥動學(xué)參數(shù)。我們推測可能的原因是鹽酸度洛西汀抑制了腸道P-糖蛋白的功能，增加了其吸收程度。試驗結(jié)果提示我們鹽酸度洛西汀和P-糖蛋白底物合用時可能通過抑制P-糖蛋白功能減少藥物外排，增加其血藥