姜黃素與其代謝產(chǎn)物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)及對(duì)P-糖蛋白功能和表達(dá)的影響.pdf

1、一、目的 采用血漿藥理學(xué)與現(xiàn)代分析技術(shù)相結(jié)合的方法，研究姜黃素與其代謝產(chǎn)物四氫姜黃素的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)及對(duì)Caco-2細(xì)胞上P-糖蛋白功能和表達(dá)的影響，研究其逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥及藥物相互作用的依據(jù)。 二、方法： (一)姜黃素單劑量藥動(dòng)學(xué)研究方法1.給藥方法采用隨機(jī)開放試驗(yàn)設(shè)計(jì)，12名健康志愿受試者單劑量口服姜黃素膠囊4粒(200mg)。 2.生物樣本采集方法分別于服藥前及服藥后0，0.25，0.5，1，1.5，2，3

2、，4，6，8，12，24和36h由肘靜脈取血5mL置肝素化離心管中，分離出血漿，置-80℃冰箱中保存待測(cè)。 3.測(cè)定方法 采用HPLC-ESI-MS/MS法測(cè)定血漿中姜黃素及其代謝產(chǎn)物四氫姜黃素的濃度。 (二)姜黃素、四氫姜黃素對(duì)P-糖蛋白的作用研究方法1．細(xì)胞培養(yǎng)以及形態(tài)學(xué)驗(yàn)證培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)，用于研究姜黃素和四氫姜黃素對(duì)P-糖蛋白功能和表達(dá)的影響。Caco-2細(xì)胞和ECV3

3、04細(xì)胞均采用DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)；細(xì)胞熒光免疫法進(jìn)行細(xì)胞膜上P-糖蛋白表達(dá)驗(yàn)證。 2．細(xì)胞毒性試驗(yàn)采用苯基溴化四氮唑藍(lán)法(MTT)，確定姜黃素和四氫姜黃素的體外最大非細(xì)胞毒性劑量，保證試驗(yàn)過程中細(xì)胞的活性，并為姜黃素、四氫姜黃素對(duì)P-糖蛋白功能和表達(dá)的作用研究提供與細(xì)胞作用的最大濃度。 3．姜黃素、四氫姜黃素和含藥血漿對(duì)P-糖蛋白功能的影響以ECV304細(xì)胞作陰性對(duì)照細(xì)胞，環(huán)孢素A作為P-糖蛋白功能抑制的陽性

4、對(duì)照，使用流式細(xì)胞術(shù)分析姜黃素、四氫姜黃素及含藥血漿對(duì)P-糖蛋白底物-羅丹明-123(Rh-123)在Caco-2細(xì)胞中外排的影響，以此反應(yīng)P-糖蛋白功能的變化。 4．從蛋白質(zhì)水平研究姜黃素、四氫姜黃素對(duì)P-糖蛋白表達(dá)的影響環(huán)孢素A作為P-糖蛋白表達(dá)上調(diào)的陽性對(duì)照，不加藥處理的Caco-2細(xì)胞作為陰性對(duì)照，采用流式細(xì)胞術(shù)分析姜黃素、四氫姜黃素對(duì)Caco-2細(xì)胞上P-糖蛋白表達(dá)的影響。 5.從mRNA水平研究姜黃素、四氫姜黃素對(duì)M

5、DR1 mRNA表達(dá)的影響環(huán)孢素A作為MDRl基因mRNA上調(diào)的陽性對(duì)照，不加藥處理的Caco-2細(xì)胞作為陰性對(duì)照，采用RT-PCR技術(shù)分析姜黃素、四氫姜黃素對(duì)Caeo-2細(xì)胞MDR1基因mRNA水平表達(dá)的影響。 三、結(jié)果： (一)姜黃素單劑量藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果1.姜黃素及四氫姜黃素的測(cè)定姜黃素和四氫姜黃素分別在0.50～37.50ng·mL-1和1.67～100.00ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測(cè)濃度分別為

6、0.125ng·mL-1和0.500ng·mL-1。萃取回收率均大于71.46％，方法回收率為94.30％～104.43％，日內(nèi)、日問RSD均小于11.92％，高、中、低三種濃度的質(zhì)控樣品穩(wěn)定性良好，濃度變異均小于15.00％。 2.姜黃素和四氫姜黃素的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)12名健康志愿者單劑量口服姜黃素后，姜黃素和四氫姜黃素的各項(xiàng)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如下：tMAX為2.42±1.93h和2.54±2.03h，t1/2為10.67±2.43h和12

7、.66±3.63h，Cmax為11.38±4.90ng·mL-1和37.10±21.98ng·mL-1， AUC0.36為128.13±49.07ng·h·mL-1和309.76±123.93ng·h·mL-1，AUC0-∞為138.83±48.21ng·h·mL-1和343.65+117.39ng·h·mL-1，CL/F為386.69±88.02mL·h-1和158.27±42.37mL-1，V/F為6080.38±2080.80mL

8、和3063.96±1480.17mL。 (二)姜黃素、四氫姜黃素對(duì)P-糖蛋白作用的研究結(jié)果1.細(xì)胞培養(yǎng)以及形態(tài)學(xué)驗(yàn)證Caco-2和ECV304細(xì)胞形態(tài)正常；Caco-2細(xì)胞高表達(dá)P-糖蛋白，可用于研究姜黃素和四氫姜黃素對(duì)P-糖蛋白功能和表達(dá)的影響；ECV304細(xì)胞基本不表達(dá)P-糖蛋白，適合作為陰性對(duì)照細(xì)胞。 2.細(xì)胞毒性試驗(yàn)姜黃素和四氫姜黃素分別在小于等于1.0pmol·L-1和5.0μmol·L-1時(shí)，與Caco-2細(xì)

9、胞培養(yǎng)72小時(shí)后，細(xì)胞的存活率大于90％。因此，選取姜黃素和四氫姜黃素的最大濃度分別為1.0μmol·L-1和5.01μm0l·L-1，進(jìn)行其對(duì)Caco-2細(xì)胞上P-糖蛋白功能和表達(dá)影響的研究。 3.姜黃素、四氫姜黃素和含藥血漿對(duì)P-糖蛋白功能的影響低、中、高濃度(0.1、0.5、1.0μmol·L-1)的姜黃素減少了羅丹明-123在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的蓄積(p<0.05)；低、中、高濃度(0.5、1.0、5.0μmol·L-1

10、)的四氫姜黃素減少了羅丹明-123在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的蓄積(p<0.05)；三個(gè)受試者的峰濃度的含藥血漿顯著減少了羅丹明-123在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的蓄積(p<0.05)；三組藥物均增強(qiáng)了P-糖蛋白的外排功能。 4.姜黃素、四氫姜黃素對(duì)P-糖蛋白表達(dá)的影響在蛋白水平上：在0.1～1.0μmol·L-1范圍內(nèi)，姜黃素組的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于陰性對(duì)照組(P<0.05)；在0.5～5.0μmol·L-1范圍內(nèi)，四氫姜黃素組的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于陰性

11、對(duì)照組(P<0.05)。說明試驗(yàn)濃度的姜黃素與四氫姜黃素對(duì)P-糖蛋白的表達(dá)有誘導(dǎo)作用，且與5.0μmol·L-1環(huán)孢素A的誘導(dǎo)作用相當(dāng)。 5.姜黃素、四氫姜黃素對(duì)MDR1 mRNA表達(dá)的影響在mRNA水平上：姜黃素組的目的條帶光密度值與β-actin光密度值之比大于陰性組(P<0.05)；四氫姜黃素組目的條帶光密度值與β-actin光密度值之比略大于陰性組(P<0.05)。說明試驗(yàn)濃度的姜黃素與四氫姜黃素對(duì)Caco-2細(xì)胞的MD

12、R1基因mRNA表達(dá)水平有上調(diào)作用。姜黃素的作用與5.0μmol·L-1環(huán)孢素相當(dāng)，四氫姜黃素的作用小于5.0μmol·L-1環(huán)孢素A。 四、結(jié)論與討論：1.本文首次報(bào)道了姜黃素在中國(guó)健康人體內(nèi)的單劑量藥動(dòng)學(xué)。研究顯示，姜黃素的生物利用度低且個(gè)體差異大。姜黃素進(jìn)入體內(nèi)很快轉(zhuǎn)化成葡萄糖醛酸結(jié)合物，其主要代謝產(chǎn)物四氫姜黃素在血漿中的濃度顯著高于姜黃素，與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道相似。 2.姜黃素和四氫姜黃素能在較低濃度以及較短時(shí)間內(nèi)(1

13、h)增強(qiáng)Caco-2細(xì)胞上P-糖蛋白的活性，增加細(xì)胞內(nèi)Rh-123的外排，從而減少Rh-123在細(xì)胞內(nèi)的蓄積。原因可能是姜黃素和四氫姜黃素在低濃度下能激活A(yù)TP酶活性增強(qiáng)了P-糖蛋白的功能，或者與其在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)了P-糖蛋白的表達(dá)有關(guān)。 3.健康受試者口服姜黃素膠囊(降脂通絡(luò)軟膠囊)后，其達(dá)峰時(shí)間的血漿樣品同樣能在極短時(shí)間內(nèi)(1h)增強(qiáng)Caco-2細(xì)胞上P-糖蛋白的活性，導(dǎo)致Rh-123的外排量增加，且程度略強(qiáng)于試驗(yàn)濃度的姜黃素