藥用輔料抑制腸道P-糖蛋白藥泵作用研究.pdf

1、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是一種170kDa大小的ATP能量依賴型的外排蛋白，即“藥物溢出泵”，能將吸收進(jìn)入漿膜側(cè)的藥物重新泵回粘膜側(cè)，導(dǎo)致藥物吸收減少，生物利用度降低。抑制P-糖蛋白的藥物溢出泵作用可有效地提高某些口服藥物的吸收率，降低肝、腎清除率。許多早期的外排泵抑制劑如維拉帕米、普羅帕酮等，會(huì)產(chǎn)生一些不可接受的毒副作用，而限制其臨床應(yīng)用。因此，尋找一些無(wú)毒、無(wú)藥理活性的逆轉(zhuǎn)劑成為國(guó)內(nèi)外藥劑學(xué)者關(guān)注的新焦點(diǎn)

2、。本論文以藥用輔料為研究對(duì)象，選用塞利洛爾為P-gp探針?biāo)幬铮捎肅aco-2細(xì)胞單層膜模型、離體小腸外翻模型、在體小腸灌流模型與原位小腸吸收模型考察P-gp藥泵作用在塞利洛爾跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)與透膜吸收中發(fā)揮的作用，比較不同藥用輔料種類(lèi)及不同濃度對(duì)P-gp藥泵作用的抑制強(qiáng)度，希望篩選出具有較強(qiáng)P-gp抑制作用的輔料。 Caco-2細(xì)胞模型已經(jīng)作為一種簡(jiǎn)便、高效的體外模型廣泛應(yīng)用于口服藥物吸收機(jī)制及候選藥物的高通量篩選。本實(shí)驗(yàn)采用Caco

3、-2細(xì)胞模型，利用測(cè)定跨膜電阻值和酚紅透過(guò)試驗(yàn)檢驗(yàn)其完整性。完整性檢測(cè)合格后可用于探針?biāo)幬锶鍫柨缒まD(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，以維拉帕米為陽(yáng)性對(duì)照，利用HPLC法測(cè)定藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量，計(jì)算跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)參數(shù)表觀滲透系數(shù)Papp與外排率ER值來(lái)評(píng)價(jià)藥用輔料對(duì)Caco-2細(xì)胞膜上P-gp外排功能的抑制作用。塞利洛爾在Caco-2細(xì)胞單層膜AP→BL方向的Papp值遠(yuǎn)小于BL→AP方向的Papp值，陽(yáng)性P-gp逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米使塞利洛爾AP→BL方向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的Pap

4、p值增加30％，BL→AP方向的Papp值降低50％，說(shuō)明P-gp在塞利洛爾跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。輔料F-68，Cremophor EL，Cremophor RH40，T-80，PEG200，PEG400，PEG4000，β-CD，HP-β-CD，PVP K30，TritonX 100，S-40可增加塞利洛爾AP→BL方向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp值并降低BL→AP方向的Papp值；T-20，T-60，PEG1000，PEG2000，PE

5、G6000，PVP K10隨濃度的提高可增加塞利洛爾AP→BL方向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp值并降低BL→AP方向的Papp值；Lecithin對(duì)塞利洛爾AP→BL方向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp值與BL→AP方向的Papp值均無(wú)明顯影響；SDS具有較大的細(xì)胞毒性使塞利洛爾AP→BL方向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp值與BL→AP方向的Papp增加異常。進(jìn)一步通過(guò)外排率ER值評(píng)價(jià)輔料抑制P-gp作用強(qiáng)度，結(jié)果表明F-68、Cremophor EL、Cremophor

6、 RH40、T-20、T-60、T-80、PEG200、PEG400、β-CD、HP-β-CD、S-40等可顯著抑制塞利洛爾細(xì)胞膜外排方向轉(zhuǎn)運(yùn)，在Caco-2細(xì)胞模型中具有明顯抑制P-gp藥泵作用。 大鼠離體外翻小腸吸收與外排模型分別選擇大鼠小腸空腸段與結(jié)腸段進(jìn)行研究。以維拉帕米作陽(yáng)性對(duì)照，考察F-68、Cremophor EL、Cremophor RH40、T-60、T-80、PEG200、PEG400、PEG1000、HP-

7、β-CD、S-40十種藥用輔料對(duì)塞利洛爾從外翻小腸囊的粘膜層向漿膜層（M→S）、漿膜層向粘膜層（S→M）轉(zhuǎn)運(yùn)情況，評(píng)價(jià)低中高輔料濃度逆轉(zhuǎn)小腸P-gp藥泵作用對(duì)塞利洛爾促吸收與抑制外排作用。離體外翻小腸吸收模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明F-68、Cremophor RH40、PEG400、T-80具有較強(qiáng)的促吸收作用；Cremophor EL、T-60、PEG200、PEG1000、S-40隨濃度提高促吸收作用增強(qiáng)；HP-β-CD對(duì)藥物M→S吸收影響不

8、大。離體外翻小腸外排模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明F-68、Cremophor EL、Cremophor RH40、T-60、T-80、PEG200、PEG400、S-40具有較強(qiáng)的抑制外排作用；PEG1000與HP-β-CD隨濃度提高抑制外排作用增強(qiáng)。 大鼠在體小腸灌流模型不僅用于評(píng)價(jià)藥物及其制劑口服吸收情況，還廣泛應(yīng)用于生物膜的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究。本文選用該模型研究F-68、Cremophor EL等10種藥用輔料對(duì)在體小腸灌流后塞利洛爾吸收的

9、影響。結(jié)果表明F-68、Cremophor EL、Cremophor RH40、T-60、T-80、PEG200、PEG400、S-40可顯著提高藥物吸收速率常數(shù)ka與有效透過(guò)系數(shù)Peff，由于塞利洛爾為P-gp典型底物，因此推斷藥物促吸收作用與抑制P-gp外排作用密切相關(guān)；但輔料PEG1000與HP-β-CD對(duì)塞利洛爾在體腸灌流吸收無(wú)明顯促進(jìn)作用。 在Caco-2細(xì)胞模型、離體與在體動(dòng)物模型研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用整體動(dòng)物模型原

10、位小腸吸收實(shí)驗(yàn)考察F-68、Cremophor EL等10種藥用輔料對(duì)塞利洛爾十二指腸處給藥后透膜吸收的影響。采用HPLC法測(cè)定血藥濃度，DAS軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，評(píng)價(jià)藥用輔料對(duì)P-gp抑制作用及促進(jìn)塞利洛爾吸收的影響。從藥時(shí)曲線結(jié)果分析，給予F-68、Cremophor EL、Cremophor RH40、T-80、PEG200、PEG400、S-40后塞利洛爾血藥濃度均有不同程度的提高，但給予輔料T-60、PEG1000、HP-

11、β-CD后塞利洛爾藥時(shí)曲線與陰性對(duì)照組相當(dāng)，遠(yuǎn)低于維拉帕米陽(yáng)性對(duì)照組水平。從藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析，給予藥用輔料后藥物半衰期t1/2有所延長(zhǎng)，清除率CL降低。同時(shí)藥時(shí)曲線下面積AUC統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明：F-68、Cremophor RH40、PEG200、PEG400、S-40高濃度組與Cremophor EL、T-80中高濃度組可明顯提高塞利洛爾藥時(shí)曲線下面積AUC，從而促進(jìn)藥物吸收；同時(shí)上述各輔料其它濃度組均可在一定程度上提高藥物AUC，

12、但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)顯著性差異。輔料T-60、PEG 1000與HP-β-CD在整體動(dòng)物模型中對(duì)塞利洛爾各參數(shù)幾乎無(wú)影響，提示上述三種輔料不影響藥物吸收過(guò)程。 選擇四種具有抑制P-gp藥泵作用的輔料逆轉(zhuǎn)劑F-68、Cremophor EL、T-80、PEG400考察其對(duì)大鼠小腸P-gp表達(dá)的影響，分別采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、運(yùn)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳與凝膠圖像分析技術(shù)、免疫印跡技術(shù)分析逆轉(zhuǎn)劑與P-gp表達(dá)之間的關(guān)系。單獨(dú)給予

13、藥物塞利洛爾或聯(lián)合給予塞利洛爾與輔料逆轉(zhuǎn)劑均可促進(jìn)P-gp表達(dá)，但發(fā)現(xiàn)輔料逆轉(zhuǎn)劑與維拉帕米可明顯誘導(dǎo)外排蛋白的進(jìn)一步表達(dá)。 選取更昔洛韋作為實(shí)驗(yàn)藥物，考察輔料逆轉(zhuǎn)劑F-68、Cremophor EL、T-80、PEG400對(duì)更昔洛韋在Caco-2細(xì)胞模型及原位小腸吸收實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭锌缒まD(zhuǎn)運(yùn)與透膜吸收情況，評(píng)價(jià)輔料逆轉(zhuǎn)劑抑制P-gp作用對(duì)提高更昔洛韋口服吸收的影響。在Caco-2細(xì)胞模型中維拉帕米與輔料逆轉(zhuǎn)劑可提高更昔洛韋AP→BL方

14、向表觀滲透系數(shù)Papp，降低BL→AP方向的表觀滲透系數(shù)Papp，從而使外排率ER值明顯下降，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明：維拉帕米組及輔料逆轉(zhuǎn)劑各中高濃度組的外排率ER值與陰性對(duì)照組間有顯著性差異，輔料逆轉(zhuǎn)劑其它濃度組也均使更昔洛韋外排率降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在原位小腸吸收實(shí)驗(yàn)中給予輔料逆轉(zhuǎn)劑F-68、Cremophor EL、T-80、PEG400后更昔洛韋血藥濃度均有一定程度的提高，其中Cremophor EL低中濃度組、T-80低濃度組、P

15、EG400低濃度組對(duì)藥時(shí)曲線下面積有顯著性影響，其它高濃度組無(wú)明顯影響。 本文通過(guò)考察20種藥用輔料在Caco-2細(xì)胞模型中抑制P-gp外排作用，篩選出10種輔料進(jìn)一步進(jìn)行離體、在體、整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃Y選，并考察具有較強(qiáng)P-gp抑制作用的輔料逆轉(zhuǎn)劑對(duì)腸道P-gp蛋白表達(dá)影響，結(jié)果表明非離子表面活性劑等藥用輔料具有抑制P-gp藥泵外排功能，減少藥物外排量，能促進(jìn)塞利洛爾與更昔洛韋腸道吸收，可提高底物藥物口服生物利用度。但輔料逆轉(zhuǎn)劑

16、在抑制P-gp藥泵外排功能的同時(shí)可促進(jìn)其蛋白表達(dá)。從作用機(jī)制角度分析，藥物吸收提高的同時(shí)蛋白表達(dá)量增加，提示抑制P-gp藥泵作用機(jī)制不是通過(guò)抑制蛋白表達(dá)而可能通過(guò)其它途徑如抑制ATP酶活性、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合位點(diǎn)、P-gp構(gòu)象改變等實(shí)現(xiàn)的。 輔料逆轉(zhuǎn)劑具有毒性低，刺激性小，生物相容性好等特點(diǎn)，可用于水溶性、脂溶性、甚至一些難溶性藥物的載體，在藥劑學(xué)領(lǐng)域?qū)?huì)有更廣泛的應(yīng)用。此外，通過(guò)抑制P-gp的外排功能，一些藥用輔料具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥