五酯片對細胞色素P450 3A和P-糖蛋白活性影響的研究.pdf

1、五酯片為五味子的乙醇提取制劑，具有抗肝細胞損傷作用，臨床上用作保肝護肝藥物使用。環(huán)孢素A和他克莫司，均為細胞色素P4503A和P-糖蛋白的底物，是臨床上常用的免疫抑制劑，廣泛用于預防器官移植術后排斥反應的發(fā)生。臨床上，五酯片常用作器官移植病人的保肝護肝藥物與環(huán)孢素A和他克莫司聯(lián)合使用，以防治免疫抑制劑所致的藥源性肝損害。本實驗室前期研究結果表明，在腎移植病人中，五酯片合用他克莫司后，五酯片可以顯著提高CYP3A和P-gp的底物他克莫司的

2、血藥濃度。那么，五酯片是否能對同樣是CYP3A和P-gp底物的環(huán)孢素A產(chǎn)生相同的作用呢?能否獲得五酯片影響CYP3A與P-gp活性的直接證據(jù)呢?
　　 因此，本課題擬在整體動物水平探討五酯片對不同劑量環(huán)孢素A藥代動力學的影響，考察五酯片通過影響CYP3A與P-gp的活性而影響環(huán)孢素A的血藥濃度的程度。另外，本課題通過使用經(jīng)典的CYP3A與P-gp陽性探針藥，評價五酯片同時對CYP3A與P-gp活性的影響，從而獲得五酯片影響CYP

3、3A與P-gp活性的直接證據(jù)，為臨床上五酯片與CYP3A與P-gp底物藥物的合理用藥提供科學數(shù)據(jù)。
　　 一、建立和確證生物樣品中環(huán)孢素A檢測的LC-MS/MS方法
　　 目的：建立并確證生物樣品中環(huán)孢素A的LC-MS/MS檢測方法。
　　 方法：采用液相色譜-串聯(lián)質譜方法檢測全血中環(huán)孢素A的血藥濃度。生物樣品采用硫酸鋅溶液及乙腈兩步沉淀蛋白后進行乙酸乙酯液-液萃取法抽提。離子源為電噴霧離子化源(ESI)；檢測方

4、式為正離子檢測；掃描方式采用選擇反應監(jiān)測(SRM)。色譜分析柱為C18 xTerra MS分析柱(3.5μm,2.1×50 mm Waters，USA)；流動相為甲醇-水(含10 mM醋酸銨)(80∶20，v/v)；流速為200μL/min；柱溫為60℃；分析時間為3 min。
　　 結果：用于定量分析環(huán)孢素A的離子反應分別為m/z1219.9→1203.6(CsA)和m/z809.8→756.6(FK520，內標)。本分析方法

5、中環(huán)孢素A的線性范圍為20～2000ng/mL，方法定量下限為20 ng/mL，生物樣品中環(huán)孢素A的線性相關程度良好(γ2均大于0.99)。以質控樣品計算該分析方法的批內精密度RSD在3.1％～6.3％范圍內，批間精密度RSD在6.0％～11.3％范圍內；生物樣品的提取回收率在47.8％～53.0％范圍內。各項穩(wěn)定性考察結果表明環(huán)孢素A在所設定實驗條件下穩(wěn)定。
　　 結論：該分析方法經(jīng)方法學確證結果滿意，樣品處理及檢測過程快速、

6、可靠，可滿足環(huán)孢素A臨床前藥代動力學研究的要求。
　　 二、五酯片對大鼠體內環(huán)孢素A藥動學的影響
　　 目的：在整體動物水平探討五酯片對不同劑量環(huán)孢素A藥代動力學的影響，考察并比較五酯片對環(huán)孢素A和他克莫司血藥濃度影響程度的異同。
　　 方法：雄性SD大鼠隨機分組后，分別灌胃給予蒸餾水、五酯片混懸液(0.25 g/kg)或地爾硫卓混懸液(8.1 mg/kg，對照組)，再灌胃給予環(huán)孢素A(37.8、1.89mg/k

7、g)。采用LC-MS/MS法測定環(huán)孢素A的血漿濃度，用非房室模型法計算各主要藥代動力學參數(shù)，并進行統(tǒng)計分析。
　　 結果：單次灌胃給予五酯片使口服環(huán)孢素A(37.8 mg/kg)的AUC0-48h增加40.1％，Cmax增加13.1％，CL/F從0.6 L/h/kg降低至0.4 L/h/kg。地爾硫卓對口服環(huán)孢素A(37.8 mg/kg)的主要藥代動力學參數(shù)Cmax、AUC、CL/F影響無統(tǒng)計學差異。單次灌胃給予五酯片使口服環(huán)孢

8、素A(1.89 mg/kg)的AUC0-36h增加293.1％，Cmax增加84.1％，CL/F從1.7 L/h/kg降低至0.5 L/h/kg。單次灌胃地爾硫卓使口服環(huán)孢素A(1.89 mg/kg)的AUC0-36h降低37.3％，Cmax降低33.7％、CL/F從1.7 L/h/kg增加至3.8 L/h/kg。
　　 結論：五酯片通過影響CYP3A與P-gp的活性來影響環(huán)孢素A的血藥濃度，五酯片對降低劑量環(huán)孢素A的血藥濃度及

9、藥代動力學參數(shù)影響更為顯著。
　　 三、同時評價體內細胞色素P4503A和P-糖蛋白活性模型的建立與確證此部分重在建立兩種經(jīng)典CYP3A和P-gp探針的檢測方法并在動物體內驗證此模型。
　　 一)、同時檢測CYP3A和P-gp探針的LC-MS/MS檢測方法
　　 目的：建立同時檢測咪達唑侖、1'-羥基咪達唑侖、地高辛的靈敏、特異、可靠的LC-MS/MS定量分析方法。
　　 方法：采用液相色譜-串聯(lián)質譜方法

10、檢測大鼠血漿中咪達唑侖、1'-羥基咪達唑侖和地高辛的濃度。大鼠血漿樣品加氨水堿化后并采用提取劑(叔丁基甲醚∶二氯甲烷=3∶1)進行液液萃取。離子源為電噴霧離子化源(ESI)；檢測方式為正離子檢測；掃描方式采用選擇反應監(jiān)測(SRM)。色譜分析柱為C18 XTerra MS分析柱(3.5μm,2.1×50 mm,Waters,USA)；流動相為甲醇-水(含5 mM甲酸銨+0.1％甲酸)(80∶20，v/v)；流速為200μL/min；分析時

11、間為3 min。
　　 結果：咪達唑侖、1'-羥基咪達唑侖、地高辛及內標洋地黃用于定量分析的離子反應m/z分別為325.9、341.9、798.0和782.0，生成的主要碎片離子m/z分別為244.1、168.1、651.0和635.0。血漿中咪達唑侖、1'-羥基咪達唑侖線性范圍均為2～400ng/mL；地高辛線性范圍為0.5～100 ng/mL；分析方法的定量下限咪達唑侖、1'-羥基咪達唑侖為2 ng/mL，地高辛為0.5 n

12、g/mL。以質控樣品計算該分析方法的批內、批間精密度RSD均在±15％范圍內；生物樣品中咪達唑侖、1'-羥基咪達唑侖、地高辛的提取回收率分別在86.8％～93.3％、84.6％～86.4％、81.7％～85.1％范圍內。各項穩(wěn)定性考察結果表明咪達唑侖、1'-羥基咪達唑侖和地高辛在常規(guī)實驗條件下穩(wěn)定。
　　 二)、評價體內細胞色素P4503A和P-糖蛋白活性模型的驗證
　　 目的：在整體動物水平闡明咪達唑侖和地高辛兩種探針

13、聯(lián)合給藥無相互串擾作用，從而建立一種在動物體內同時評價CYP3A和P-gp活性的模型。
　　 方法：雄性SD大鼠隨機分組后，每組大鼠分別灌胃給予地高辛混懸液(0.25mg/kg)，或者灌胃給予咪達唑侖混懸液(15 mg/kg)，或者灌胃給予咪達唑侖混懸液(15 mg/kg)，30分鐘后再灌胃給予地高辛混懸液(0.25 mg/kg)，或者同時灌胃給予咪達唑侖混懸液(15 mg/kg)和地高辛混懸液(0.25 mg/kg)。采用LC

14、-MS/MS法測定咪達唑侖、1'-羥基咪達唑侖和地高辛的血漿濃度。用非房室模型法計算各主要藥代動力學參數(shù)，并進行統(tǒng)計分析。
　　 結論：本部分研究建立并確證了同時檢測生物樣品中咪達唑侖、1'-羥基咪達唑侖和地高辛的簡單、靈敏、可靠的LC-MS/MS方法，能滿足兩種探針藥物的藥代動力學研究的要求。在整體動物水平考察咪達唑侖和地高辛藥代動力學特征，闡明咪達唑侖和地高辛聯(lián)合給藥無相互串擾作用，從而建立和驗證了一種在動物體內同時評價CY

15、P3A和P-gp活性的模型。
　　 四、五酯片對細胞色素P4503A和P-糖蛋白活性的影響
　　 目的：利用第三部分在動物體內已經(jīng)建立的同時評價CYP3A和P-gp活性的模型來研究五酯片對咪達唑侖、地高辛藥代動力學的影響，獲得五酯片影響CYP3A和P-gp活性的直接證據(jù)。
　　 方法：雄性SD大鼠隨機分成組后，分別灌胃給予蒸餾水、五酯片(0.25 g/kg)，再灌胃給予咪達唑侖混懸液(15 mg/kg)，30分鐘

16、后再灌胃給予地高辛混懸液(0.25 mg/kg)。于給前(0 h)、給藥(咪達唑侖)后0.083、0.17、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、8、12 h從右頸靜脈取血約0.25 mL。用非房室模型法計算各主要藥代動力學參數(shù)，并進行統(tǒng)計分析。
　　 結果：與單獨服用咪達唑和地高辛侖組相比，五酯片使口服咪達唑侖及地高辛的血藥濃度升高，使咪達唑侖AUC0-4h升高34.5％、Cmax增加13.4％，CL/F

17、從18.5L/h/kg降低至5.8 L/h/kg，使地高辛AUC0-12h升高55.1％、Cmax增加74.9％，CL/F從2.6L/h/kg降低至1.7L/h/kg。與單獨服用咪達唑侖和地高辛組相比，五酯片對1'-羥基咪達唑侖的血藥濃度及主要藥代動力學參數(shù)沒有顯著影響。
　　 結論：本部分研究表明，五酯片抑制了CYP3A和P-gp的活性從而使得咪達唑侖和地高辛的血藥濃度升高。從而獲得五酯片影響CYP3A與P-gp活性的直接證據(jù)

18、。
　　 綜上所述，五酯片對CYP3A和P-gp底物環(huán)孢素A及經(jīng)典探針藥咪達唑侖和地高辛的血藥濃度均有影響，但五酯片對降低劑量環(huán)孢素A的血藥濃度影響更為顯著。利用經(jīng)典的陽性探針藥同時評價五酯片對體內CYP3A與P-gp活性影響的實驗結果表明，五酯片抑制了CYP3A和P-gp的活性從而使得咪達唑侖和地高辛的血藥濃度升高。以上研究結果可獲得五酯片影響CYP3A和P-gp活性的直接證據(jù)，為臨床上五酯片與CYP3A與P-gp底物藥物的合