人外周血來源內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）轉(zhuǎn)染自殺基因CD-UPRT治療惡性膠質(zhì)瘤的體外研究.pdf

1、惡性膠質(zhì)瘤是常見的顱腦腫瘤，也是血管最豐富的人類實(shí)體腫瘤之一。由于具有較強(qiáng)的侵襲性和易復(fù)發(fā)，惡性膠質(zhì)瘤的治療至今仍難以攻克。在許多針對惡性膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)治療方法中，有些方法已通過體外和動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，并進(jìn)入臨床試驗(yàn)。但迄今的結(jié)果證明，這些方法仍不能根本改變這一惡性腫瘤的致命轉(zhuǎn)歸。近十余年來，有關(guān)腫瘤分子生物學(xué)與分子遺傳學(xué)研究進(jìn)一步深化，闡明了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)多因素、多基因、多階段的復(fù)雜過程，也提示對腫瘤綜合治療的理念和方法也應(yīng)多

2、渠道，多靶點(diǎn)，多時(shí)相。 我們實(shí)驗(yàn)設(shè)想是，通過對經(jīng)外周血誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的EPCs進(jìn)行基因修飾，使其攜帶聯(lián)合自殺基因CD-UPRT(cytosinedeaminase-uracilphosphoribosyltransferase)；EPCs對腫瘤血管具有趨向性，可以到達(dá)腫瘤部位并原位整合入腫瘤血管內(nèi)皮，彌散入腫瘤實(shí)質(zhì)[1]；給予前體藥物后，EPCs發(fā)生凋亡，破壞腫瘤血管生成；同時(shí)EPCs凋亡而產(chǎn)生的旁觀者效應(yīng)進(jìn)一步殺傷腫瘤細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)

3、將探討以腫瘤血管和腫瘤細(xì)胞為雙重靶點(diǎn)聯(lián)合應(yīng)用抗血管生成療法和自殺基因療法的可行性。本研究將重點(diǎn)完成外周血分離誘導(dǎo)培養(yǎng)EPCs并對其進(jìn)行基因修飾；觀察經(jīng)CD-UPRT基因修飾的EPCs對前體藥物5-FC的反應(yīng)性及旁效應(yīng)對惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外殺傷作用。研究結(jié)果將為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 將外周血經(jīng)密度梯度離心得到的單個(gè)核細(xì)胞，用含有誘導(dǎo)因子的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基EGM-2體外誘導(dǎo)培養(yǎng)。在培養(yǎng)第7天時(shí)大部分細(xì)胞拉長呈梭形，部

4、分細(xì)胞呈極性排列，并有克隆集落形成，說明所得細(xì)胞已開始向內(nèi)皮細(xì)胞分化；吞噬ac-LDL(acetylated-low-densitylipoprotein)并與UEA-1(ulexeuropaeusagglutinin)結(jié)合證實(shí)了其具有內(nèi)皮細(xì)胞表型；免疫熒光檢測到CD34、CD133、VEGFR-2的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測各種指標(biāo)陽性細(xì)胞比例為：CD34+占37.645％，CD133+占45.655％，VEGFR-2+占57.3％，其中C

5、D34+與CD133+雙陽性細(xì)胞占29.44％，CD34+與VEGFR-2+雙陽性細(xì)胞占28.38％。體外誘導(dǎo)培養(yǎng)可使EPCs較培養(yǎng)初期擴(kuò)增近100倍。通過粘附和Transwell實(shí)驗(yàn)證明了所得細(xì)胞有良好的粘附能力和向VEGF等趨化因子的遷移能力。接著我們用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將攜帶聯(lián)合自殺基因CD-UPRT真核表達(dá)載體pCEACDCAUP轉(zhuǎn)入EPCs內(nèi)，并通過RT-PCR法檢測到經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群有自殺基因CD及UPRT的mRNA表達(dá)。

6、為了進(jìn)一步證明經(jīng)轉(zhuǎn)染的EPCs表達(dá)CD-UPRT基因，我們觀察了不同濃度5-FC對經(jīng)基因修飾后EPCs細(xì)胞群以及野生型EPCs活性的影響，將5-FC系列稀釋后加入培養(yǎng)基中作用72h，發(fā)現(xiàn)兩者對5-FC的反應(yīng)有明顯差異。當(dāng)5-FC系列稀釋濃度在0.001～1000μg/ml時(shí)，對野生型EPCs無明顯毒性作用，但是5-FC為10μg/ml時(shí)，經(jīng)基因修飾的EPCs群的存活率就已低于50％，100μg/ml時(shí)細(xì)胞大部分死亡而僅有6％存活。據(jù)此，

7、我們將100μg/ml作為旁效應(yīng)研究中的5-FC給藥濃度。 在旁效應(yīng)觀察實(shí)驗(yàn)中，我們將基因修飾的EPCs群和膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251按不同比例混合后共培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入100μg/ml5-FC，72小時(shí)后觀察細(xì)胞生長抑制率。發(fā)現(xiàn)各種混合比例組的細(xì)胞生長抑制率皆大于基因修飾型EPCs群所占的比例，提示有旁效應(yīng)發(fā)生，且旁效應(yīng)隨著基因修飾型EPCs群比例的增加而放大。當(dāng)基因修飾型EPCs群與U251比例為1:1時(shí)，旁效應(yīng)明顯，細(xì)胞生長抑制率

8、高達(dá)80％以上。 綜上，在本研究中我們成功分離、擴(kuò)增并鑒定了人外周血來源的EPCs。經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)導(dǎo)了CD-UPRT的EPCs細(xì)胞群有效表達(dá)CD-UPRTmRNA，并可增強(qiáng)前藥物5-FC對基因轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。旁效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，證明了旁效應(yīng)隨基因修飾型EPCs在U251細(xì)胞中的混入比例增加而擴(kuò)大；50％的基因修飾EPCs群所引發(fā)旁效應(yīng)就足以殺死大部分細(xì)胞，細(xì)胞生長抑制率高達(dá)80％以上。至此，我們本研究為轉(zhuǎn)導(dǎo)了自殺基因CD—UPRT