鈣鎂離子環(huán)境改變對人惡性膠質(zhì)瘤原代細胞侵襲力影響的體外研究.pdf

1、背景和目的：膠質(zhì)細胞瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤,占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40％。膠質(zhì)瘤易復(fù)發(fā)、預(yù)后差,其主要原因是膠質(zhì)瘤侵襲性生長的生物學(xué)特性使各種治療措施難以達到治愈目的。而鈣離子在腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移中是一個關(guān)鍵的離子信號;鎂離子作為天然的鈣離子拮抗劑,其對腫瘤細胞浸潤的影響也值得關(guān)注。腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是由腫瘤細胞和基質(zhì)成分共同參與完成的,其中的基本步驟是對ECM和血管基底膜的降解和破壞。實驗證明,瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移的能力與其誘

2、導(dǎo)產(chǎn)生蛋白酶降解細胞外基質(zhì)(Extra Cell Matrix,ECM)、基底膜的能力密切相關(guān)。在腫瘤組織中,基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞與ECM的黏附,降解腫瘤細胞外基質(zhì)成分,增加腫瘤新生血管形成來參與腫瘤的侵襲生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞體外培養(yǎng)液加入鈣鎂離子可以改變腫瘤細胞分泌MMPs的能力,從而對腫瘤細胞的侵襲力有所影響。原代培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng),是從供體取得離體細胞后在體外

3、進行的首次培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細胞因組織和細胞剛剛離體,生物學(xué)性狀未發(fā)生明顯變化,最接近和反映體內(nèi)的生長特性。目前,已有部分人類的膠質(zhì)瘤細胞被成功培養(yǎng),其中以星形細胞瘤報道居多,而室管膜瘤細胞尤其是人類室管膜瘤細胞的原代培養(yǎng)國內(nèi)卻未有報道。傳統(tǒng)的膠質(zhì)瘤細胞分離法為酶消化法和機械分散法,本實驗首次采用“機械分散法+胰酶消化法”的綜合分離方法培養(yǎng)星形細胞瘤細胞和室管膜瘤細胞,并將三種分離方法各自的特點加以對比,以期找出更為廉價,有效的原代細胞的

4、培養(yǎng)方法。本實驗在原代細胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上通過體外調(diào)節(jié)鈣,鎂離子濃度的變化探討離子環(huán)境的改變對人惡性膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力的影響,從而進一步探討膠質(zhì)瘤侵襲性生長的分子機制。
　　材料和方法：1.取新鮮手術(shù)標(biāo)本并做常規(guī)病理檢查本實驗取膠質(zhì)細胞瘤手術(shù)后的新鮮離體標(biāo)本,一部分送常規(guī)病理檢查,剩余大小約1cm×1cm×1cm的組織無菌包裹,送入無菌培養(yǎng)間培養(yǎng)。對用常規(guī)病理檢查(HE及免疫組化)證實為星形細胞瘤和室管膜瘤的標(biāo)本繼續(xù)培養(yǎng)。2.膠質(zhì)瘤

5、標(biāo)本的處理應(yīng)用機械分散法+胰酶消化法分離細胞。200目濾網(wǎng)過濾后的細胞懸液按800~1000 r/min離心5min后去上清,培養(yǎng)液重懸后調(diào)整細胞濃度并接種。3.膠質(zhì)瘤的原代培養(yǎng)用上述分離方法得到的細胞,細胞懸液計數(shù)1×106/ml后,在DMEM培養(yǎng)基(加10％胎牛血清)、37℃、5％CO2條件下、培養(yǎng)板中培養(yǎng),每隔3~4d換培養(yǎng)液1次;細胞長滿底部70％~80％后,用0.25％胰蛋白酶消化,細胞計數(shù),傳代。繼續(xù)培養(yǎng),對細胞進行形態(tài)學(xué)觀

6、察、免疫細胞化學(xué)鑒定,取生長良好的第三代細胞棄去其帶有FBS的DMEM培養(yǎng)液,加入新鮮的不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液,并在其內(nèi)添加鈣鎂離子,調(diào)節(jié)鈣離子濃度分別為0.8mmol/L,1.2mmol/L,1.6 mmol/L,2.0 mmol/L,調(diào)節(jié)鎂離子濃度分別為0.5 mmol/L,1.0 mmol/L,1.5mmol/L,2.0 mmol/L,不含鈣鎂離子的作為空白對照組。將這些細胞培養(yǎng)24時后取其細胞和上層懸液分別做Boyden c

7、hamber侵襲小室實驗和聚丙烯酰胺明膠酶譜電泳。4.細胞形態(tài)學(xué)觀察用倒置相差顯微鏡觀察活細胞的形態(tài)學(xué)和生長狀態(tài)的變化,觀察不同級別的星形細胞瘤和室管膜瘤的形態(tài)學(xué)和生長狀態(tài)。5.免疫細胞化學(xué)鑒定采用SP法,對星形細胞瘤檢測膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、Ⅳ型膠原(CollagenⅣ)和巢蛋白(nestin)的表達。對室管膜瘤細胞檢測GFAP、CD99和EMA的表達。6.Boyden chamber實驗Boyden chamber小室測定原

8、代培養(yǎng)的Ⅲ級、Ⅳ級星形細胞瘤細胞及Ⅱ級、Ⅲ級室管膜瘤細胞,在相同的培養(yǎng)時間和不同的培養(yǎng)條件下,觀察鈣鎂離子影響下的不同級別的膠質(zhì)瘤細胞侵襲力的差別。7.明膠酶譜法檢測MMP-2酶和酶原的表達情況。明膠酶譜法檢測不同濃度鈣鎂離子影響下的不同級別的膠質(zhì)瘤細胞MMP-2酶和酶原的表達情況的差別,從而判斷體外鈣鎂離子濃度的不同對膠質(zhì)瘤細胞侵襲力影響的差別。8.統(tǒng)計學(xué)處理以上結(jié)果用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計處理,數(shù)據(jù)結(jié)果采用(?)±S表示,方差

9、分析,以a=0.05為顯著性水平。
　　結(jié)果：1.常規(guī)病理檢查診斷為星形細胞瘤的手術(shù)標(biāo)本20例,共培養(yǎng)成活16例,其中Ⅲ級(間變性星形細胞瘤)7例,Ⅳ級(膠質(zhì)母細胞瘤)9例;室管膜細胞瘤的手術(shù)標(biāo)本11例,成活9例,其中室管膜瘤(Ⅱ級)7例,間變性室管膜瘤(Ⅲ級)2例。2.原代培養(yǎng):應(yīng)用物理和化學(xué)方法,成功地培養(yǎng)出星形細胞瘤和室管膜瘤原代細胞。腫瘤級別不同,細胞的生長活性不同,其中Ⅲ級、Ⅳ級星形細胞瘤可以成活并可穩(wěn)定傳代4-6代(約

10、28d),Ⅱ,Ⅲ級室管膜瘤可以成活且能傳4-5代(約25d)。3.形態(tài)學(xué)觀察:倒置顯微鏡下,發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)多樣,大小不一;其中星形細胞瘤細胞呈星形、三角形、菱形或梭形。腫瘤級別越高,細胞貼壁時間越短,生長越旺盛,并呈交錯性生長(細胞失去極性);室管膜瘤細胞呈玫瑰花結(jié)狀排列,大小不一,胞質(zhì)豐富,無分枝狀突起。4.免疫細胞化學(xué)檢查:原代培養(yǎng)的星形細胞瘤GFAP呈陽性、Ⅳ型膠原CollagenⅣ呈陰性,nestin陽性(Ⅳ級星形細胞瘤);原代培

11、養(yǎng)的室管膜細胞瘤GFAP呈陽性、CD99陽性,EMA陰性。為此,結(jié)合細胞的形態(tài)、生長方式及免疫細胞化學(xué)結(jié)果,證實所培養(yǎng)的細胞分別為星形細胞瘤細胞和室管膜細胞瘤細胞。5.Boyden小室體外侵襲實驗結(jié)果:原代培養(yǎng)的Ⅲ級、Ⅳ級星形細胞瘤細胞,Ⅱ,Ⅲ級室管膜瘤細胞隨著體外鈣離子濃度的升高,其穿膜細胞數(shù)先增高后降低,隨著鎂離子濃度的升高,其穿膜細胞數(shù)呈降低趨勢。在侵襲實驗中,在相同的培養(yǎng)時間和培養(yǎng)條件下,與Ⅲ級星形細胞瘤細胞相比,Ⅳ級星形細胞瘤

12、細胞不同時間的穿膜細胞數(shù)均高于Ⅲ級星形細胞瘤細胞,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與Ⅱ級室管膜瘤細胞相比,Ⅲ級室管膜瘤細胞不同時間的穿膜細胞數(shù)均高于Ⅱ級室管膜瘤細胞,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。6.明膠酶譜的凝膠電泳結(jié)果:原代培養(yǎng)的Ⅲ級、Ⅳ級星形細胞瘤細胞,Ⅱ,Ⅲ級室管膜瘤細胞隨著體外鈣鎂離子離子濃度的不同,出現(xiàn)4到5條透明條帶,分子量為62kD,64kD,72kD,82kD和92kD,分別是MMP-2、MMP-2中介體、p

13、roMMP-2、MMP-9和proMMP-9。隨鈣離子濃度的升高,MMP-2的含量先增高后降低,隨著鎂離子濃度的升高,MMP-2的含量呈降低趨勢。鈣離子的組別之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),鎂離子的組別之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)
　　結(jié)論：1.采用“機械分散法+胰酶消化法”的綜合分離法可較好的進行星形細胞瘤和室管膜瘤組織的原代細胞培養(yǎng),是經(jīng)濟、有效的膠質(zhì)瘤原代培養(yǎng)的方法。2、原代培養(yǎng)的星形細胞瘤細胞的形態(tài)區(qū)別于