人乳頭瘤病毒16型E5與IL-12聯(lián)合基因疫苗的免疫效果研究.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建人乳頭瘤病毒16型(HPV16)E5蛋白真核與原核表達(dá)載體,分析E5與IL-12聯(lián)合基因疫苗接種BALB/c小鼠后的免疫活性,為HPV防治性疫苗的研制奠定前期試驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　(1)運(yùn)用PRIMER5.0軟件設(shè)計(jì)HPV16 E5基因特異性引物,PCR擴(kuò)增E5基因,經(jīng)BamHI、EcoRI或NotI雙酶切后將其分別連接入pcDNA3.1(+)或pGEX-6P-1相應(yīng)酶切位點(diǎn);PCR及酶切鑒定插入

2、片段,篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行 DNA序列分析,構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/E5與原核表達(dá)載體pGEX-6P-1/E5。
　　(2)將質(zhì)粒pGEX-6P-1/E5轉(zhuǎn)化E.coli BL21,用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),純化表達(dá)產(chǎn)物,Western-blot檢測(cè)GST-HPV16 E5純化產(chǎn)物。將質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/E5轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,利用RT-PCR測(cè)定HPV16 E5 mRNA表達(dá)。
　　(3)將50只BALB/

3、c小鼠隨機(jī)分為pcDNA3.1(+)/E5組、pcDNA3.1(+)/E5+ pcDNA3.1(+)/IL-12組、pcDNA3.1(+)/IL-12組、pcDNA3.1(+)組和PBS空白組,每組10只。將100?g質(zhì)?；?00?L PBS分別通過(guò)肌肉接種小鼠,隔2周接種1次,共接種4次。每次免疫前一天收集血清。末次免疫后第14天收集小鼠血清后,取小鼠脾臟制備脾細(xì)胞懸液并培養(yǎng);另取小鼠股四頭肌制成石蠟切片。
　　(4)ELISA

4、間接法測(cè)定小鼠血清中抗HPV16 E5特異性IgG水平,ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4含量,MTT比色法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),免疫組織化學(xué)法檢測(cè)E5蛋白在小鼠肌肉組織中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　(1)DNA測(cè)序結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增得到252bp HPV16 E5基因片段,并分別連接入pcDNA3.1(+)與 pGEX-6P-1載體。構(gòu)建的pcDNA3.1(+)/E5真核表達(dá)載體在H

5、eLa細(xì)胞表達(dá)了HPV16 E5 mRNA。
　　(2)構(gòu)建的pGEX-6P-1/E5原核表達(dá)載體在 E.coli BL21中表達(dá)分子量約35kDa GST-HPV16 E5融合蛋白;Western-blot檢測(cè)該重組蛋白能與抗HPV16 E5抗體結(jié)合,表達(dá)的融合蛋白分子量約35kDa。
　　(3)聯(lián)合基因疫苗組[pcDNA3.1(+)/E5+pcDNA3.1(+)/IL-12]和單基因疫苗組[pcDNA3.1(+)/E5]

6、血清 IgG抗體水平隨免疫時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì);最后一次免疫的血清 IgG A450值分別為(0.771±0.051)和(0.330±0.078),明顯高于pcDNA3.1(+)組(0.080±0.035)、pcDNA3.1(+)/IL-12組(0.110±0.015)和PBS組(0.078±0.020)(P<0.01);且聯(lián)合基因疫苗組顯著高于單基因疫苗組(P<0.01)。
　　(4)聯(lián)合基因疫苗組和單基因疫苗組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中

7、IFN-γ和IL-4含量最高,分別為(352.89±36.76 pg/ml、680.23±36.04 pg/ml)和(206.53±15.40 pg/ml、359.94±48.23pg/ml),均明顯高于 pcDNA3.1(+)組(18.04±2.24 pg/ml、40.41±4.11pg/ml)、 pcDNA3.1(+)/IL-12組(42.15±4.89pg/ml、177.59±24.33pg/ml)、pcDNA3.1(+)組(18

8、.04±2.24pg/ml、40.41±4.11pg/ml)、PBS組(14.98±2.03 pg/ml、25.73±2.02 pg/ml)(P<0.01);且聯(lián)合基因疫苗組顯著高于單基因疫苗組(P<0.01)。聯(lián)合基因疫苗組和單基因疫苗組脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)分別為(2.14±0.27)和(1.85±0.11),顯著高于pcDNA3.1(+)組(1.19±0.07)、pcDNA3.1(+)/IL-12組(1.24±0.12)和PB

9、S組(1.13±0.15)(P<0.01);聯(lián)合基因疫苗組與單基因疫苗組比較,SI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。小鼠股四頭肌組織中有HPV16 E5蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　(1)構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/E5能在真核細(xì)胞中表達(dá)HPV16 E5。
　　(2)構(gòu)建的原核表達(dá)載體pGEX-6P-1/E5能在E.coli表達(dá)融合蛋白GST-HPV16 E5,并具有良好的抗原性。
　　(3)HPV