HPV18 E2與IL-12聯(lián)合核酸疫苗的免疫效果初步研究.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建人乳頭瘤病毒18型(HPV18)E2基因真核表達載體pcDNA3.1(+)/E2，將其與IL-12真核表達載體pcDNA3.1(+)/IL-12聯(lián)合免疫BALB/c小鼠，檢測小鼠產(chǎn)生的特異性體液免疫和細胞免疫應答水平，為HPV18誘發(fā)的宮頸癌治療性核酸疫苗的研制奠定實驗基礎。
　　方法：
　　(1)用PRIMER5.0軟件設計HPV18 E2基因引物，PCR擴增E2基因，將其插入pGEX-6P-2載體，

2、構(gòu)建重組載體pGEX-6P-2/E2，并進行序列分析。將重組質(zhì)粒pGEX-6P-2/E2轉(zhuǎn)化表達宿主菌E.coliBL21(DE3)， IPTG誘導表達，純化目的蛋白，并分析其抗原性。
　　(2)將E2基因克隆至真核細胞表達載體 pcDNA3.1(+)，構(gòu)建 E2真核細胞表達載體 pcDNA3.1(+)/E2，并進行序列分析。將質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/E2轉(zhuǎn)染 HeLa細胞，Western blot鑒定 E2蛋白在 HeLa細

3、胞中的表達。
　　(3)將35只6w齡BALB/c小鼠隨機分為5組，即pcDNA3.1(+)/E2+pcDNA3.1(+)/IL-12組、pcDNA3.1(+)/E2組、pcDNA3.1(+)/IL-12組、空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)組及PBS組。將200μg質(zhì)粒肌肉注射小鼠，隔2周注射1次，共注射4次。首次免疫當天及其后第2、4、6周剪尾取血,第8周摘眼球放血處死小鼠，分離血清，-20℃保存待測；無菌取小鼠脾臟，制備脾細胞懸液

4、。
　　(4) ELISA間接法測定小鼠血清中E2 IgG抗體水平，ELISA雙抗體夾心法檢測脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4水平，MTT比色法檢測脾細胞增殖反應，免疫熒光組化法檢測E2蛋白在小鼠肌肉組織中的表達。
　　結(jié)果：
　　(1)構(gòu)建的pGEX-6P-2/E2原核表達載體經(jīng)SDS-PAGE分析，能在E.coli中由IPTG誘導表達一相對分子量約為68 kD GST-E2融合蛋白。
　　(2)構(gòu)建的真核

5、表達載體pcDNA3.1(+)/E2能在HeLa細胞內(nèi)表達一相對分子量約為42 kD E2蛋白；且在小鼠肌肉組織中也能有效表達。
　　(3)小鼠接種 pcDNA3.1(+)/E2+pcDNA3.1(+)/IL-12核酸疫苗后能產(chǎn)生特異性IgG，8w后ELISA測定血清抗體A450值為0.859，效價為1:2048。
　　(4)核酸疫苗 pcDNA3.1(+)/E2+pcDNA3.1(+)/IL-12免疫組小鼠脾細胞經(jīng)特異性抗

6、原刺激后，培養(yǎng)上清中 IFN-γ、IL-4含量明顯升高(分別為400.60±26.23pg/mL，767.15±37.96 pg/mL)，與空質(zhì)粒組(分別為20.88±1.93 pg/mL、37.32±3.63pg/mL)及 pcDNA3.1(+)/IL-12組(分別為44.84±5.99 pg/mL、176.99±24.34 pg/mL)之間差異具有顯著性(P<0.01)，與 pcDNA3.1(+)/E2免疫組(分別為226.83±1

7、2.55pg/mL、377.44±41.88pg/mL)之間的差異也具有顯著性（P<0.01）。
　　(5)pcDNA3.1(+)/E2+pcDNA3.1(+)/IL-12組和pcDNA3.1(+)/E2核酸疫苗組小鼠脾細胞經(jīng)特異性抗原刺激后，刺激指數(shù)(分別為2.33±0.05和2.04±0.05)明顯高于空質(zhì)粒組(1.31±0.05)、PBS組(1.16±0.04)及pcDNA3.1(+)/IL-12組(1.39±0.03)(P

8、<0.01)。
　　結(jié)論：
　　(1)成功構(gòu)建的原核表達載體pGEX-6P-2/E2能在原核細胞內(nèi)表達具有良好抗原性的GST-E2融合蛋白。
　　(2)成功構(gòu)建的真核表達載體pcDNA3.1(+)/E2能在真核細胞中表達HPV18E2蛋白。
　　(3) pcDNA3.1(+)/E2+pcDNA3.1(+)/IL-12聯(lián)合核酸疫苗和pcDNA3.1(+)/E2單核酸疫苗均能刺激機體產(chǎn)生較強細胞免疫應答和體液免疫應答