家蠶microRNA Novel-31-對家蠶溶血素基因的表達的調控.pdf

1、miRNA（microRNA）是一類內源性非編碼小RNA分子，長度約為20~25個核苷酸。miRNA通過與靶基因非翻譯區(qū)結合調控靶基因的表達，參與調控機體多種生理過程。本實驗室前期研究中在家蠶感染質型多角體病毒（BmCPV）72h及96h后對中腸組織進行Solexa測序，發(fā)現(xiàn)數(shù)個差異表達的小RNA，且其中有新發(fā)現(xiàn)的miRNA。本實驗選擇其中一條新發(fā)現(xiàn)的miRNA Novel-31*作為實驗研究對象，采用生物信息學分析預測其靶基因，通過構

2、建miRNA及靶基因慢病毒表達載體，轉染293T細胞，驗證Novel-31*對靶基因表達的調控作用。同時采用化學法合成Novel-31* mimics，在家蠶細胞BmN及蠶體水平驗證Novel-31*對靶基因的表達調控作用。得到如下實驗結果：
　　1、家蠶感染BmCPV后Novel-31*及其靶基因表達發(fā)生變化
　　利用RNAhybrid及NCBI Blast等生物信息學在線軟件預測，發(fā)現(xiàn)溶血素基因是miRNA Novel-

3、31*的靶基因之一。通過primer5.0設計溶血素基因qRT-PCR引物及Novel-31* stem-loop qRT-PCR引物，家蠶感染BmCPV后，不同時間點取家蠶血淋巴及中腸組織，定量檢測Novel-31*及溶血素基因表達變化。結果發(fā)現(xiàn)，家蠶感染BmCPV后，Novel-31*在血淋巴中的表達量明顯升高，中腸組織中在感染96h后表達量上調；家蠶感染BmCPV后，溶血素基因在血淋巴中表達量明顯升高，在中腸組織中表達基本無差異。

4、
　　2、Novel-31*對溶血素基因表達具有正調控作用
　　（1）設計Novel-31*及溶血素5′UTR引物，擴增相應序列，分別構建表達Novel-31*和靶基因5′UTR+GST的慢病毒表達載體pLKO.3G-miR-N31*及pLNHX-UTR-GST。先將重組質粒pLNHX-UTR-GST轉染293T細胞，72h后獲得穩(wěn)定表達5′UTR+GST基因序列的293T細胞，然后將重組質粒pLKO.3G-miR-N31*

5、轉染該293T細胞，24h及48h后收集細胞，以新霉素基因neo為內參，qRT-PCR定量檢測溶血素基因及GST標簽基因的表達變化。結果發(fā)現(xiàn)，Novel-31*能夠上調GST標簽的表達，說明Novel-31*能夠與溶血素基因5′UTR序列結合，且正調控溶血素基因的表達。
　　（2）為進一步驗證Novel-31*對家蠶溶血素基因的調控作用，采用化學法人工合成了Novel-31* mimics。將Novel-31* mimics轉染家

6、蠶BmN細胞，檢測溶血素基因的表達變化。結果表明，家蠶BmN細胞轉染Novel-31* mimics24h后，溶血素基因表達無明顯差異，48h后溶血素基因呈現(xiàn)顯著的上調表達，至72小時該基因仍然呈上調表達，但上調表達水平有所下降，可能是由于人工合成的mimics發(fā)生降解，NC組與空白對照組，溶血素基因表達均無明顯差異。該結果直接證明了Novel-31*對溶血素基因的表達起正調控作用。
　?。?）采用體腔注射方法，分別將不同濃度No

7、vel-31* mimics注射家蠶體內，不同時間點取家蠶血淋巴及中腸組織，定量檢測溶血素基因的表達變化。結果發(fā)現(xiàn)，注射不同濃度Novel-31* mimics，溶血素基因在血淋巴和中腸組織中均明顯上調表達，注射DEPC水和Negative control組，溶血素基因表達量無明顯差異。進一步證明溶血素基因是Novel-31*靶基因之一，且Novel-31*正調控靶基因的表達。
　　本實驗對 Novel-31*及其靶基因溶血素基因