滯育誘導(dǎo)溫度和光照節(jié)律對(duì)家蠶滯育相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、家蠶(Bombyxmori)是卵滯育性鱗翅目模式昆蟲(chóng)，受親代卵孵化期(催青期)溫度、光節(jié)律等環(huán)境因子誘導(dǎo)，并受產(chǎn)下后溫度誘導(dǎo)決定表現(xiàn)。本文以經(jīng)典的家蠶滯育卵誘導(dǎo)條件催青期蠶卵及胚后幼蟲(chóng)與蠶蛹，調(diào)查家蠶滯育激素基因dh、滯育特征能量代謝限速酶山梨醇脫氫酶基因sdh、家蠶滯育生物鐘蛋白基因ea4以及家蠶抗氧化酶基因sod和過(guò)氧化氫酶基因cat的表達(dá)譜，從滯育誘導(dǎo)與活化調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)與環(huán)境互作的角度研究了家蠶活化的分子機(jī)制。主要獲得了以下結(jié)

2、果：
　　 1.家蠶5個(gè)滯育相關(guān)基因的表達(dá)存在顯著的組織和性別差異性
　　 家蠶大造品種5齡幼蟲(chóng)期基因芯片表達(dá)譜顯示，dh基因、adh基因和cat表達(dá)水平存在性別差異與組織差異，雌蠶的多個(gè)組織dh基因表達(dá)水平都顯著低于雄性；雄蠶的sdh基因表達(dá)豐度顯著高于雌蠶，而卵巢的sdh基因表達(dá)豐度高于精巢；cat基因除在卵巢的表達(dá)水平高于精巢外，其它組織的表達(dá)量都低于雄性。ea4基因、sod基因和cat基因在不同組織中的表達(dá)有顯著

3、差異性，ea4基因和sod基因在后部絲腺都只有痕跡量表達(dá)，而表達(dá)豐度最高的組織分別為頭部和體壁，cat則在不同組織中的表達(dá)有極顯著的差異性。
　　 10個(gè)家蠶品種的ESTs表達(dá)譜分析顯示，ea4基因表達(dá)具有組織(器官)和發(fā)育時(shí)期的差異性，前胸腺表達(dá)最高，而生殖腺?zèng)]有表達(dá)；成蟲(chóng)期表達(dá)量顯著高于其它發(fā)育時(shí)期，其中剛羽化成蟲(chóng)的前胸腺與被微生物感染5齡幼蟲(chóng)的脂肪體中ea4基因表達(dá)豐度顯著上調(diào)。
　　 2.誘導(dǎo)子代滯育卵發(fā)生的高溫

4、與光照條件上調(diào)家蠶dh基因表達(dá)
　　 催青期在誘導(dǎo)子代滯育卵發(fā)生的高溫25℃與持續(xù)光照條件下，蠶卵有穩(wěn)定的、高水平dh基因mRNA存在，而誘導(dǎo)子代非滯育卵發(fā)生的低溫15℃與持續(xù)黑暗條件下，蠶卵中幾乎檢測(cè)不到dh基因的mRNA存在。在25LL或者20LD催青環(huán)境中，胚胎發(fā)育至單眼形成后(積溫高于2160℃.h)，蠶卵中的dh基因表達(dá)水平開(kāi)始顯著上調(diào)，這與在此階段的蠶卵胚胎對(duì)滯育誘導(dǎo)環(huán)境溫度和光節(jié)律更加敏感相一致，但dh基因表達(dá)水平

5、沒(méi)有出現(xiàn)隨不同滯育誘導(dǎo)溫度或光節(jié)律變化的振蕩節(jié)律，表明蠶卵胚胎的dh基因表達(dá)受到滯育誘導(dǎo)溫度和光照這兩個(gè)近日節(jié)律授時(shí)因子的影響，但不是節(jié)律授時(shí)因子直接調(diào)控的基因。
　　 從催青期開(kāi)始的整個(gè)世代保護(hù)溫度和光照，對(duì)家蠶胚后時(shí)期砌基因的表達(dá)水平影響，呈現(xiàn)高溫25℃上調(diào)dh基因的表達(dá)。親代卵孵化期的催青溫度與光照，影響了子代卵的滯育性，也影響了子代卵內(nèi)的dh基因mRNA水平，但這種影響與蠶卵的滯育性不完全一致。
　　 3.親代卵

6、高溫環(huán)境催青能夠下調(diào)家蠶整個(gè)世代sdh基因表達(dá)
　　 催青期的25℃高溫和持續(xù)光照，顯著下調(diào)蠶卵sdh基因表達(dá)；在20LD催青條件下，蠶卵sdh基因靈敏地受到滯育誘導(dǎo)溫度和光照這兩個(gè)近日節(jié)律授時(shí)因子的影響，但沒(méi)有出現(xiàn)隨不同滯育誘導(dǎo)溫度變化的振蕩節(jié)律；整個(gè)世代維持在誘導(dǎo)子代卵發(fā)生滯育的25LL環(huán)境下，幼蟲(chóng)至蠶蛾時(shí)期各階段體內(nèi)(生殖腺)sdh基因的表達(dá)水平總體低于20LD環(huán)境；親代不同溫度孵化處理結(jié)果表明，25℃條件下子代卵在孵化后

7、期進(jìn)入滯育，sdh基因的轉(zhuǎn)錄水平也隨之降低。
　　 4.光照對(duì)該環(huán)境中的蠶卵和子代卵的sdh基因表達(dá)影響不同
　　 親代卵催青期低溫條件下的持續(xù)光照，有顯著下調(diào)蠶卵sdh基因表達(dá)的作用；親代催青期低溫條件下的持續(xù)光照，有上調(diào)子代卵sdh基因表達(dá)的作用。催青期光照對(duì)處于該光照環(huán)境中的親代蠶卵和子代卵的sdh基因表達(dá)影響呈現(xiàn)相反的結(jié)果。
　　 5.家蠶TIME-EA4的滯育生物鐘活性不依賴基因表達(dá)水平的上調(diào)
　

8、　 雖然催青期在15DD環(huán)境中，蠶卵ea4基因轉(zhuǎn)錄水平顯著低于25LL，和20LD環(huán)境，但溫度和光照節(jié)律的振蕩改變，沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的蠶卵胚胎的ea4基因轉(zhuǎn)錄水平變化。胚后時(shí)期家蠶幼蟲(chóng)與蠶蛹的ea4基因具有發(fā)育階段與組織(器官)的顯著表達(dá)差異，在不同滯育誘導(dǎo)環(huán)境之間也有差異，但與滯育誘導(dǎo)發(fā)生條件無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，而是與自由基代謝相關(guān)。
　　 子代卵滯育發(fā)生和活化過(guò)程中ea4基因的表達(dá)結(jié)果顯示，授精前(處女蛾卵)都具有高水平ea4mRNA

9、存在，而授精后0.5h-12h迅速被降解；合子形成后，轉(zhuǎn)錄本水平逐漸升高，滯育性卵在卵齡12h、無(wú)滯育性卵在卵齡24h后達(dá)到授精前水平，并在24h-72h的滯育發(fā)生期，以及72h以上的滯育完成期，一直維持此水平，也無(wú)滯育性差異。鹽酸活化處理卵齡24h的滯育性卵，卵內(nèi)EA4的ATPase活性在處理后1.5h左右出現(xiàn)；5℃低溫冷藏卵齡48h的滯育性卵，活性則在冷藏13d左右出現(xiàn)，但這2個(gè)過(guò)程都沒(méi)有檢測(cè)到ea4基因轉(zhuǎn)錄水平升高。提示家蠶滯育性

10、卵活化啟動(dòng)時(shí)的EA4生物鐘活性出現(xiàn)不依賴ea4基因表達(dá)。
　　 6.棉鈴蟲(chóng)ea4同源基因的克隆、分子進(jìn)化及組織表達(dá)
　　 Haea4基因全長(zhǎng)eDNA799bp，編碼199個(gè)氨基酸。蛋白序列分析表明，Haea4分子量18768.88，等電點(diǎn)5.45。Haea4基因有明顯的信號(hào)肽序列，屬于分泌蛋白。含有Cu/ZnSOD核心結(jié)構(gòu)域、N-糖基化位點(diǎn)、N-?；稽c(diǎn)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)和蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)。蛋白同源性分析結(jié)果

11、表明，HaEA4在不同物種中的保守性較高。分子進(jìn)化分析表明，棉鈴蟲(chóng)和家蠶、野桑蠶的TIME-EA4同源蛋白質(zhì)都與Cu-Zn/SOD蛋白的進(jìn)化距離較近，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析也顯示，棉鈴蟲(chóng)與家蠶的TIME-EA4基本特性有很大相似性。該基因在棉鈴蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)有一定差異，中腸、脂肪體、體壁表達(dá)量較高，頭部、生殖腺、絲腺表達(dá)量相對(duì)較低，提示Haea4基因的分布與酯酶發(fā)揮代謝解毒的功能是一致的。氨基酸遺傳距離和同源性分析表明，棉鈴蟲(chóng)的TIME

12、-EA4與家蠶和野蠶間的遺傳距離分別為0.536，0.548，同源性均為44％。
　　 7.滯育誘導(dǎo)溫度和光節(jié)律對(duì)家蠶抗氧化酶基因sod和過(guò)氧化氫酶基因cat表達(dá)譜的影響
　　 催青期25LL環(huán)境，蠶卵sod基因表達(dá)除孵化時(shí)顯著下調(diào)外，其它時(shí)期有高水平的sodmRNA存在；20LD催青環(huán)境，蠶卵sod基因表達(dá)量高于15DD，在孵化后期胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育完全后更加顯著；cat基因在25LL、20LD和15DD環(huán)境之間的表達(dá)量

13、沒(méi)有顯著差異，孵化后期(積溫2160-3600℃.h)，cat基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，這與在此階段的蠶卵胚胎對(duì)滯育誘導(dǎo)環(huán)境溫度和光節(jié)律更加敏感相一致。
　　 sod基因在人工活化卵中的表達(dá)水平顯著高于非浸酸的滯育性卵；卵齡24-192h，25LL條件下子代卵逐漸進(jìn)入滯育，sod基因表達(dá)量下調(diào)；溫度和光照對(duì)家蠶子代卵期sod基因的表達(dá)水平影響，呈現(xiàn)低溫黑暗上調(diào)sod基因的表達(dá)。cat基因在人工活化卵初期mRNA水平下降，低于滯育性卵