家蠶滯育生物鐘蛋白質(zhì)EA4基因的結(jié)構(gòu)以及時空表達(dá)研究.pdf

1、家蠶是卵滯育昆蟲，蠶業(yè)生產(chǎn)上通過低溫冷藏和鹽酸處理等方法解除蠶卵滯育。酯酶A4(EsteraseA4，EA4)是一種能夠感受蠶卵活化所需低溫時間或酸刺激而發(fā)生蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)變化，獲得瞬時ATPase活性的時間間隔測定酶(TIME)，被稱作家蠶滯育生物鐘蛋白質(zhì)。 本實驗以家蠶C108品種為材料，根據(jù)本實驗室完成的eα4基因cDNA的ORF序列(NCBI登陸號：DQ086424)，利用快速擴增cDNA末端法獲得了其全長cDNA。測序

2、結(jié)果表明，eα4基因全長cDNA 606 bp，ORF為519 bp，編碼172個氨基酸。根據(jù)NCBI家蠶基因組數(shù)據(jù)，推斷家蠶eα4基因至少含有4個外顯子、3個內(nèi)含子。由于家蠶全基因組數(shù)據(jù)存在缺口，通過拼接、修復(fù)GAP得到eα4基因從第2個外顯子到第4個外顯子全部序列，但第1個內(nèi)含子序列未能確定。 用核酸雜交技術(shù)以及半定量RT-PCR方法調(diào)查了eα4基因在家蠶5齡幼蟲和蛹期不同組織的表達(dá)情況。隨機引物地高辛(digoxygeni

3、n，DIG)標(biāo)記eα4基因cDNA的核酸點雜交結(jié)果表明，在家蠶5齡幼蟲和蛹期，eα4基因的表達(dá)不存在組織和性別特異性。采用Actin3基因做陽性對照，RT-PCR檢測eα4基因的表達(dá)譜，結(jié)果在家蠶5齡幼蟲和蛹期，eαt4，基因不存在發(fā)育時期的表達(dá)特異性，在絲腺、造血器官、中腸和脂肪體eα4基因的mRNA表達(dá)量較高，而在卵巢中表達(dá)量較低。證明了EA4蛋白質(zhì)可能由家蠶造卵時期的幼蟲至成蟲期親代非特異性合成后儲存于卵。 為了在基因表達(dá)

4、水平進一步研究EA4蛋白質(zhì)的生物測時機理，根據(jù)家蠶蛋白質(zhì)EA4具有卵期瞬時ATPase活性(即生物鐘活性)和整個卵期超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性的特點，本文研究了家蠶以及野桑蠶eα4基因cDNA、EA4蛋白及SOD蛋白結(jié)構(gòu)特點。比較家蠶和野桑蠶(NCBI：DQl54907)的eα4基因，兩者的ORF同源性97％，蛋白同源性為99％。克隆野桑蠶的Cu/Zn-sod基因cDNA(NCBI登陸號：AM

5、410997)后，推測的家蠶與野桑蠶SOD蛋白質(zhì)氨基酸同源性為100％，家蠶EA4與SOD蛋白質(zhì)的同源性為46％。家蠶EA4與Cu/Zn-SOD蛋白質(zhì)有著相似的活性位點，包括金屬配基氨基酸和二硫鍵，但N末端的相似性不高，這是EA4的特有結(jié)構(gòu)，這部分是β-折疊重復(fù)空間結(jié)構(gòu)，柔軟可動，推測為EA4的計時功能的活性中心，是瞬時ATPase計時活性出現(xiàn)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，而EA4的鋼性結(jié)構(gòu)域可能是一直具有SOD活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。從基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析推測