極大節(jié)旋藻生物鐘基因的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、生物鐘是生物體隨外界環(huán)境做周期性變化的一種現(xiàn)象，而生物鐘節(jié)律則源于生物體內(nèi)的生物鐘基因。藍(lán)藻作為最早報(bào)道具有生物鐘節(jié)律的原核生物受到了人們的重視，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻生物鐘調(diào)控著許多代謝途徑和基因的表達(dá)，生物鐘的調(diào)控作用是藍(lán)藻自身調(diào)控的一種重要機(jī)制。節(jié)旋藻(Arthrospria)因其重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和特殊的生物學(xué)性質(zhì)而受到廣泛關(guān)注，但節(jié)旋藻生物鐘基因方面的研究尚屬空白，對(duì)節(jié)旋藻的生物鐘節(jié)律更是缺乏了解。 本研究通過構(gòu)建PCR反

2、應(yīng)池的方法對(duì)節(jié)旋藻基因組DNA的fosmid文庫進(jìn)行篩選得到含kai基因簇的陽性克隆4個(gè)。測(cè)序得到3820bp的DNA片段，其中含有完整的kai基因簇。分析發(fā)現(xiàn)節(jié)旋藻的kai基因簇由kaiA、kaiB、kaiC三個(gè)基因組成，kaiA、kaiB、kaiC基因的編碼區(qū)(Open Reading frame，ORF)，長(zhǎng)度分別為858bp、315bp、1554bp，它們?cè)诨蚪M中以ABC的順序依次排列構(gòu)成節(jié)旋藻的kai基因簇。kaiA、kai

3、B、kaiC基因ORF的GC堿基含量基本持平，分別為39.86％、39.37％、41.76％。密碼子分析發(fā)現(xiàn)，kai基因簇密碼子第三位偏向于堿基U，其中kaiC基因密碼子的偏向性最為明顯。啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)在kaiA、kaiB基因編碼區(qū)前發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的啟動(dòng)子序列，kaiB與kaiC間隔區(qū)也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可能的啟動(dòng)子序列，對(duì)發(fā)現(xiàn)的啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)了GATA盒。對(duì)Kai蛋白分析發(fā)現(xiàn)，KaiA蛋白含有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪氨酸

4、激酶磷酸化位點(diǎn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)有14個(gè)α螺旋、6個(gè)β折疊，并與PDB數(shù)據(jù)庫中Thermosynechococcus elongatus bp-1的KaiA蛋白的折疊方式相似，結(jié)構(gòu)一致性為64.5％。KaiB蛋白含有N端?；稽c(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)有5個(gè)α螺旋、5個(gè)β折疊，與PDB數(shù)據(jù)庫中魚腥藻PCC 7120的KaiB蛋白的折疊方式相近，結(jié)構(gòu)一致性為96.7％。 KaiC蛋白中不僅

5、發(fā)現(xiàn)N端?；稽c(diǎn)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、N端糖基化位點(diǎn)，而且還發(fā)現(xiàn)了一些具有重要的功能的模體walker A、DXXG等，二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)有18個(gè)α螺旋、22個(gè)β折疊，與PDB數(shù)據(jù)庫中聚球藻PCC 7942的KaiC蛋白的折疊方式相近，結(jié)構(gòu)一致性為81.6％。蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹分析發(fā)現(xiàn)，Kai蛋白都比較保守，其中KaiC蛋白的保守性最高，KaiA蛋白的保守性最低。本研究還

6、對(duì)已知的kai基因簇設(shè)計(jì)探針，Southem雜交分別測(cè)定了kai基因在節(jié)旋藻基因組內(nèi)的拷貝數(shù)。雜交結(jié)果顯示kaiA、kaiB、kaiC基因均為單拷貝，證明極大節(jié)旋藻FACHB 438只含有kai基因簇，而不含游離于基因簇外的kai基因，間接證明kai基因是有功能的。 本研究還對(duì)92小時(shí)不同培養(yǎng)條件下的極大節(jié)旋藻的kai基因簇表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在持續(xù)光照條件下，節(jié)旋藻kai基因簇表達(dá)具有明顯的12小時(shí)的節(jié)律，而在對(duì)照組(1