展示白念菌毒性分子表位的雜合噬菌體誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答及免疫檢測研究.pdf

1、白色念珠菌是一種條件致病菌,當(dāng)機體的免疫力下降或者正常菌群平衡被破壞時,會侵入深層組織引起系統(tǒng)性白色念珠菌感染。隨著腫瘤放療、化療和大量廣譜抗生素的使用,系統(tǒng)性白色念珠菌感染的發(fā)病率不斷升高。由于白色念珠菌感染缺少明顯的臨床癥狀,所以導(dǎo)致早期診斷困難。臨床上多采用血培養(yǎng)法,這種方法需要經(jīng)過反復(fù)培養(yǎng),耗時長、檢出率低(僅為44％左右),并且通常在感染的晚期才能得到陽性結(jié)果,患者往往錯過最佳的治療時機。因此,尋找系統(tǒng)性白色念珠菌感染的早期檢

2、測方法對于該類疾病的診斷和治療是非常重要的。
　　 白色念珠菌感染過程中,體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答都發(fā)揮了重要的作用。分泌型天冬氨酸蛋白酶2(Sap2)和熱休克蛋白90(Hsp90)是白色念珠菌的兩個毒性分子。這兩種抗體在白色念珠菌感染中都有保護作用。Sap2是一種蛋白水解酶,在感染的早期就發(fā)揮作用,參與降解宿主組織、逃避免疫保護等多個過程。Sap2能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng),是一種免疫優(yōu)勢抗原。Hsp90是白色念珠菌另一個

3、重要的毒性分子,也參與多種生理過程。白色念珠菌康復(fù)患者血清中含有Hsp90抗體,而惡化和死亡患者則沒有或者含有很少該抗體。CD4+Th細胞的分化方向也是影響宿主對白色念珠菌抗性或易感的重要方面。Th1型細胞免疫應(yīng)答能夠抑制感染,分泌的細胞因子具有保護作用,而Th2型免疫應(yīng)答則使宿主對白色念珠菌易感。這對于研究白色念珠菌感染的診斷試劑和疫苗具有指導(dǎo)意義。
　　 本實驗室前期工作證明,展示抗原表位的雜合噬菌體,在沒有佐劑的情況下,就

4、能夠誘導(dǎo)實驗動物產(chǎn)生特異性抗體。雜合噬菌體還能誘導(dǎo)小鼠的DTH反應(yīng)、延長感染小鼠的存活時間、降低感染小鼠的死亡率。本論文將白色念珠菌Sap2的VKYTS表位展示在噬菌體表面,并對其誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答進行了研究。同時利用四種抗原,Sap2重組蛋白、展示Sap2 VKYTS表位的雜合噬菌體、Hsp90重組蛋白、展示Hsp90 C表位的雜合噬菌體構(gòu)建了間接ELISA方法,對系統(tǒng)性白色念珠菌感染兔血清和癌癥患者血清進行了檢測。

5、得到結(jié)果如下:
　　 (1)Sap2的VKYTS表位成功展示在噬菌體表面,雜合噬菌體在不需要佐劑的條件下就能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗展示表位的特異性抗體,還能識別癌癥患者血清中的特異性抗體。
　　 (2)體內(nèi)RT—PCR和體外夾心ELISA實驗結(jié)果證明,雜合噬菌體、與匙孔藍蛋白(KLH)偶聯(lián)的LKVIRKNIVKKMIE表位和重組蛋白免疫小鼠后都可以誘導(dǎo)小鼠脾細胞產(chǎn)生Th1型細胞因子。在RNA和蛋白水平,Th1型細胞因子IFN—

6、γ、IL-2和IL—12的水平都明顯升高,與對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異,而三個免疫組之間沒有差異。三種免疫原對Th2型細胞因子的產(chǎn)生沒有影響。
　　 (3)通過環(huán)磷酰胺和氫化可的松免疫抑制成功建立了系統(tǒng)性白色念珠菌感染兔模型,檢測結(jié)果證明,在感染過程中Sap2抗體的產(chǎn)生要早于Hsp90抗體。
　　 (4)在檢測的141例癌癥患者血清中分別有46、44、52、48例血清對Sap2重組蛋白、展示Sap2 VKYTS表位的雜合噬

7、菌體、Hsp90重組蛋白、展示Hsp90 C表位的雜合噬菌體陽性。經(jīng)過分析證明,雖然重組蛋白的檢出率略高于雜合噬菌體,但沒有統(tǒng)計學(xué)差異,二者聯(lián)合使用可以提高檢出率。
　　 因此,噬菌體展示的抗原表位能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體。作為一種新型的生物載體,噬菌體與化學(xué)合成載體和重組蛋白具有類似的作用,能夠誘導(dǎo)Th1型細胞因子的產(chǎn)生。在白色念珠菌感染檢測中,與重組蛋白具有相似的檢出率。而其制備簡單、省時省力的優(yōu)點使噬菌體在疫苗研究和檢測試劑