苯噻菌酯競(jìng)爭(zhēng)和非競(jìng)爭(zhēng)噬菌體酶聯(lián)免疫分析方法的研究.pdf

1、免疫分析具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏、低成本、高通量的特點(diǎn)，已在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中廣泛研究，異源競(jìng)爭(zhēng)和非競(jìng)爭(zhēng)模式是農(nóng)藥殘留免疫分析的研究熱點(diǎn)之一。噬菌體展示技術(shù)為快速建立異源競(jìng)爭(zhēng)和非競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)技術(shù)提供了途徑。本文通過(guò)制備苯噻菌酯模擬表位噬菌體展示多肽和抗苯噻菌酯免疫復(fù)合體噬菌體展示多肽，建立了靈敏度更高、特異性更強(qiáng)的苯噻菌酯免疫分析方法。
　　建立了苯噻菌酯高效液相色譜(HPLC)分析方法，采用C18反相色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，以乙

2、腈∶水(65∶35，v/v)為流動(dòng)相，峰形對(duì)稱、響應(yīng)值高。在0.05-10.0mg/L濃度范圍內(nèi)，苯噻菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。在番茄和大米基質(zhì)中的平均添加回收率為80.83％-100.46％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.25％-5.54％，滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求。
　　利用抗苯噻菌酯單克隆抗體，從環(huán)形八肽隨機(jī)噬菌體展示文庫(kù)(Ph.D.-C8Clibrary)中淘選出20種不同氨基酸序列的苯噻菌酯模擬表位噬菌體展示多肽

3、和3種抗苯噻菌酯免疫復(fù)合體噬菌體展示多肽。模擬表位多肽具有三種特征序列，分別為TPXGSL、GLAXFM和PXGAXH(X代表不同的氨基酸);抗免疫復(fù)合體多肽含有一種特征序列為PXIWPXXW為建立檢測(cè)苯噻菌酯的競(jìng)爭(zhēng)和非競(jìng)爭(zhēng)噬菌體酶聯(lián)免疫分析方法提供了必要的核心試劑。
　　利用淘選獲得的苯噻菌酯模擬表位噬菌體展示多肽，建立了苯噻菌酯競(jìng)爭(zhēng)噬菌體ELISA方法。選擇了最優(yōu)的噬菌體C3-3，并對(duì)包被抗體濃度、噬菌體投入量以及緩沖液等條件

4、進(jìn)行了優(yōu)化。在最優(yōu)條件下，競(jìng)爭(zhēng)噬菌體ELISA的抑制中濃度(IC50)為0.94μg/L，最低檢測(cè)限(LOD，IC10)為0.22μg/L，線性范圍為(IC10-IC90)為0.22-3.94μg/L，靈敏度比傳統(tǒng)ic-ELISA方法提高了8倍。方法除與吡唑醚菌酯的交叉反應(yīng)率為0.34％外，與其他結(jié)構(gòu)類似物均無(wú)交叉反應(yīng)。在番茄、梨、黃瓜和大米四種基質(zhì)中的平均添加回收率為67.6％-119.6％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2％-12.8％，符合農(nóng)

5、藥殘留檢測(cè)的要求。競(jìng)爭(zhēng)噬菌體ELISA對(duì)真實(shí)樣品的檢測(cè)結(jié)果與HPLC的檢測(cè)結(jié)果接近，兩種方法對(duì)大米樣品中苯噻菌酯殘留量的檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性方程為y=0.948x+0.437，相關(guān)系數(shù)為R2=0.981;番茄樣品中的相關(guān)性方程為y=1.109x+11.88，相關(guān)系數(shù)為R2=0.981。研究結(jié)果表明，基于噬菌體展示多肽模擬表位可建立高靈敏的異源競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于農(nóng)產(chǎn)品中苯噻菌酯的檢測(cè)。
　　基于淘選獲得的抗苯噻

6、菌酯免疫復(fù)合體噬菌體展示多肽，建立了苯噻菌酯非競(jìng)爭(zhēng)噬菌體ELISA方法.。選擇最優(yōu)的噬菌體N6-18，并對(duì)包被抗體濃度、噬菌體投入量以及緩沖液等條件進(jìn)行了優(yōu)化。在最優(yōu)的工作濃度條件下，苯噻菌酯的飽和中濃度(SC50)為2.27μg/L，最低檢測(cè)限(LOD，SC10)為1.11μg/L，線性范圍為(SC10-SC90)1.11-4.62μg/L，靈敏度比傳統(tǒng)ic-ELISA方法提高了3倍，與其他結(jié)構(gòu)類似化合物的交叉反應(yīng)率均小于0.03％。

7、在番茄、梨、黃瓜和大米四種基質(zhì)中的平均添加回收率為70.43％-128.57％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.79％-11.53％，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求。非競(jìng)爭(zhēng)噬菌體ELISA的檢測(cè)結(jié)果與HPLC的檢測(cè)結(jié)果相吻合，對(duì)大米樣品檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性方程為y=1.073x-9.558，相關(guān)系數(shù)為R2=0.996;對(duì)番茄樣品檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性方程為y=0.962x-7.429，相關(guān)系數(shù)為R2=0.997。研究結(jié)果表明，利用抗免疫復(fù)合體可建立苯噻菌酯非競(jìng)爭(zhēng)免疫分