鄰苯二甲酸二甲酯人工抗原包被的酶聯(lián)免疫分析方法的建立.pdf

1、鄰苯二甲酸二甲酯(Dimethylphthalate，DMP)，是鄰苯二甲酸酯類化合物中的一種，主要作為增塑劑應(yīng)用于食品包裝、醫(yī)療設(shè)備、建筑裝修材料以及家庭生活用品中。隨著增塑劑的廣泛使用，DMP被大量釋放出來進入環(huán)境。環(huán)境中的DMP可通過呼吸或飲食等方式被人體吸收。研究發(fā)現(xiàn):DMP對人體健康具有毒性作用，已被我國列為優(yōu)先控制的環(huán)境污染物。
　　目前，國內(nèi)外對DMP的檢測方法主要有氣相色譜(Gas chromatography，G

2、C)、高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）和氣相色譜-質(zhì)譜(Gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS)聯(lián)用技術(shù)，這些方法都能精確地檢測出DMP的含量，但樣品前期處理操作復(fù)雜、耗時長，需要高檔的儀器設(shè)備，不便于現(xiàn)場檢測。為方便測定DMP在環(huán)境中的污染水平，建立一種快速、簡便、靈敏度高、低成本的方法檢測環(huán)境和生活用品中DMP的含量具有

3、重要的科學(xué)意義。
　　酶聯(lián)免疫分析(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)具有操作簡便快速、靈敏度高、不需昂貴的儀器設(shè)備、可在現(xiàn)場一次檢測多個樣本等優(yōu)點，被認為是現(xiàn)場檢測環(huán)境污染物的經(jīng)典方法。
　　本研究采用重氮法將小分子化合物4-氨基鄰苯二甲酸二甲酯(Dimethyl-4-aminophthalate，DMAP)與牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）和

4、卵清蛋白（Ovalbumin, OVA）進行偶聯(lián)合成人工抗原DMAP-BSA和DMAP-OVA。通過篩選，選用DMAP-BSA作為免疫原免疫Balb/c小鼠。6次免疫結(jié)束后，獲得高效價和高靈敏度抗血清。采用雜交瘤技術(shù)融合免疫效果最佳小鼠的脾細胞和SP2/0細胞，通過ELISA法檢測雜交瘤細胞陽性和對DMP的特異性，篩選出一株能穩(wěn)定分泌DMP單克隆抗體細胞株DMP-2C11，夾心ELISA法檢測出DMP-2C11細胞株分泌抗體的亞型是Ig

5、G2a。DMP-2C11細胞株擴大培養(yǎng)后，通過小鼠腹水法大量制備DMP的單克隆抗體，辛酸-硫酸銨法提純腹水抗體，方陣滴定法確定最佳人工抗原包被濃度為0.5μg/mL，單抗最佳稀釋倍數(shù)為4000。ELISA最適檢測條件:5％脫脂奶粉作封閉劑、二抗反應(yīng)溫度為37℃，鄰苯二胺（O-phenylenediamine，OPD）作顯色劑。建立的人工抗原包被的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線y=19.68 Log(x)+20.71，相關(guān)系數(shù)R2為0.993，線性檢