川楝素間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法（IC-ELISA）初步研究.pdf

1、川楝素是從楝屬植物中分離得到的一種殺蟲活性物質(zhì)，以其為主要有效成分研制開發(fā)出的植物源殺蟲劑，已應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲防治。隨著川楝素制品在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的使用和推廣，建立高效，快速，靈敏的川楝素檢測方法，對進一步開展川楝素的環(huán)境安全性，作用機理、質(zhì)量標準建立等方面的研究有著重要意義。本研究以川楝素為研究對象，開展了川楝素人工抗原的合成及其多克隆抗體的制備研究，并進行了川楝素間接競爭EUSA方法的建立及其確證研究。主要研究結(jié)果如下： 1.成功

2、合成了川楝素的人工抗原。合成了川楝素的兩種半抗原，經(jīng)HRMS、NMR及IR確證為琥珀酸單酰川楝素(TS)和戊二酸單酰川楝素(TG)；采用混合酸酐法(MA)合成了兩種免疫原TS-BSA和TG-BSA，采用活化酯法(AE)合成了兩種包被原TS-OVA和TG-OVA，并經(jīng)紫外光譜掃描法和紅外光譜掃描法進行了鑒定。 2.獲得了抗川楝素的特異性多克隆抗體。用兩種免疫原TS-BSA和TG-BSA分別免疫新西蘭大白兔后，均獲得了抗川楝素的特異

3、性抗體。采用間接ELISA法和間接競爭EIASA法對抗體的鑒定結(jié)果表明：首次加強免疫后，兩種免疫原免疫的兔子體內(nèi)均已產(chǎn)生了抗川楝素的特異性抗體，并隨著加強免疫次數(shù)的增多，抗體含量也不斷增加，測得兩種免疫原TS-BSA和TG-BSA免疫的兔子最高效價分別為：1/64,000和1/320,000。 3.建立了川楝素的間接競爭ELISA方法并進行了確證。用篩選出的抗體TS-Ab和TG-Ab，在優(yōu)化的條件下(10％甲醇的PBS溶液作為待

4、測物的溶解劑，pH 7.4的PBS作為抗體的稀釋液，酶標二抗工作濃度為1/4,000，以2.0μg/ml的TG-OVA作為包被原，抗體工作濃度分別為1/9,000和1/60,000)，分別建立了川楝素的IC-ELISA檢測方法。以(TS-Ab,TG-OVA)組合建立的川楝素IC-ELISA方法，半數(shù)抑制濃度(IC50)為1.3266μg/ml，最低檢測限(IC10)為0.0363μg/ml，在線性檢測范圍0.01—50μg/ml內(nèi)，抑制

5、率的幾率值與濃度對數(shù)呈線性相關(guān)，得線性方程為y=0.8203x+4.8993，r=0.9917；以(TG-Ab,TG-OVA)建立的IC-ELISA方法，川楝素的IC50為3.0323μg/ml，IC10為0.1178μg/ml，在0.1-50μg/ml線性范圍內(nèi)，得線性方程為y=0.9084x+4.5623，r=0.9858;用(TS-Ab,TG-OVA)組合建立的IC-ELISA方法檢測自來水中川楝素的添加回收率為82.4％-106