自身免疫抗體噬菌體庫(kù)的構(gòu)建及初步鑒定.pdf

1、研究目的： 自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AID)是指機(jī)體對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損傷所引起的疾病，是一類(lèi)較常見(jiàn)的難治病。其突出特點(diǎn)是患者體內(nèi)產(chǎn)生高滴度自身抗體，并通過(guò)免疫復(fù)合物等途徑，產(chǎn)生針對(duì)自身組織的免疫病理性損傷，累及一個(gè)或全身多個(gè)器官、系統(tǒng)。自身免疫病發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及因素眾多。一般認(rèn)為以免疫活性細(xì)胞數(shù)量和功能的失常，導(dǎo)致免疫功能紊亂，從而產(chǎn)生大量自身抗體為主要機(jī)制，但具體機(jī)制并

2、不明確。因而自身抗體的研究往往成為對(duì)自身免疫性疾病研究的關(guān)鍵點(diǎn)和切入點(diǎn)。 目前，自身免疫病的診斷手段非常有限，主要是在結(jié)合臨床的基礎(chǔ)上，依賴(lài)實(shí)驗(yàn)室檢查，在AID患者體內(nèi)檢測(cè)到一種或多種高效價(jià)的自身抗體為診斷該病的重要依據(jù)。自身免疫病缺乏特異的早期診斷指標(biāo)及特效的治療藥物，這都直接影響了疾病的診斷和治療。因此，一獲得純化的可以滿(mǎn)足不同需要的高親和力、高特異性自身抗體對(duì)于研究自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制及臨床診療都具有非常重要的價(jià)值。

3、 抗體的制備工藝歷經(jīng)100多年的發(fā)展，經(jīng)歷了從多克隆抗體、單克隆抗體到人源化抗體的不同階段。在人源單克隆抗體的制備技術(shù)中，噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是迄今發(fā)展最成熟、應(yīng)用最廣泛的抗體制備技術(shù)之一。利用此技術(shù)，外源蛋白或多肽的基因與噬菌體外殼蛋白的基因融合，外源產(chǎn)物表達(dá)在噬菌體的表面，從而實(shí)現(xiàn)了基因型與表現(xiàn)型的完美統(tǒng)一。目前，國(guó)內(nèi)外已成功構(gòu)建了針對(duì)乙肝病毒、腫瘤細(xì)胞等多種抗原的噬菌體抗體庫(kù)，并從中篩選得到具有較高親和力和特異性的抗體，潛藏著巨

4、大的應(yīng)用價(jià)值。 本課題采用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，以50多例自身免疫病患者的外周血淋巴細(xì)胞為原料，構(gòu)建出自身免疫性疾病的噬菌體抗體庫(kù)，并以確定的自身抗原dsDNA作為固相抗原，從抗體庫(kù)中篩選、富集出相關(guān)抗體，以鑒定所構(gòu)建抗體庫(kù)的有效性，為進(jìn)一步利用該抗體庫(kù)篩選出不同需要的抗體及其功能研究提供平臺(tái)。 研究方法： 1．從55名自身免疫性疾病患者(包括SLE、RA、強(qiáng)直性脊柱炎、干燥綜合征、PBC 等)外周血中分離出

5、單個(gè)核細(xì)胞，抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以?xún)?nèi)參GADPH驗(yàn)證混合cDNA的質(zhì)量； 2．以上述cDNA為模板PCR擴(kuò)增輕鏈和重鏈基因； 3．挑取XL1-Blue的單克隆菌落，采用Hepes法制備感受態(tài)細(xì)胞； 4．將輕鏈基因克隆入pComb3Hss載體以構(gòu)建輕鏈庫(kù)； 5．將重鏈基因載入重組輕鏈庫(kù)，構(gòu)建組合文庫(kù)H+L+pComb3Hss； 6．將組合文庫(kù)轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue，加入輔助噬菌體

6、M13K07，隨機(jī)的組合文庫(kù)表達(dá)于噬菌體表面，完成噬菌體表面展示； 7．用商品化anti-dsDNA ELISA試劑盒，對(duì)噬菌體抗體進(jìn)行4輪親和富集，測(cè)定抗體庫(kù)滴度； 8．間接ELISA法鑒定4輪淘選后的噬菌體抗體，提取陽(yáng)性克隆的的噬菌粒，切除gIII片段，自連接后轉(zhuǎn)化XL1-Blue，以IPTG誘導(dǎo)可溶性Fab片段的表達(dá)； 9．分別用anti-dsDNA和anti-U1RNP檢測(cè)試劑盒對(duì)制備好的Fab片段進(jìn)行E

7、LISA檢測(cè)，鑒定其抗原特異性。 結(jié)果： 1．抽取總RNA7-10ug，抽提的RNA質(zhì)量可靠，經(jīng)GADPH驗(yàn)證的cDNA質(zhì)量可靠； 2．PCR擴(kuò)增了大小為660bp的輕鏈κ、λ基因及重鏈Fd基因，并成功構(gòu)建了重組輕鏈庫(kù)，菌落計(jì)數(shù)得輕鏈庫(kù)的庫(kù)容約4×105，酶切鑒定重組率為80％； 3．同法測(cè)得噬菌體抗體庫(kù)的庫(kù)容為6×106，酶切鑒定重組率為70％，PCR鑒定證明輕重鏈均已轉(zhuǎn)入，噬菌體抗體庫(kù)構(gòu)建成功；

8、 4．用抗原固相法對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行了4輪親和富集，第1輪沈脫的滴度為1.1×105，第2、3輪都較前有較大提高，第4輪產(chǎn)出率比第1輪加了218倍； 5．通過(guò)固相化抗原吸附法篩選獲得2個(gè)陽(yáng)性克隆，切除gIII基因，實(shí)現(xiàn)了可溶性Fab片段的表達(dá)； 6．間接ELISA法檢測(cè)顯示6株Fab片段克隆均呈dsDNA陽(yáng)性，U1RNP陰性，證實(shí)獲得的可溶性抗體Fab片段具有特異性抗原結(jié)合活性。 結(jié)論： 利用自身免疫性