抗性蛋白Sw--5b與番茄斑萎病毒無(wú)毒因子NSm識(shí)別位點(diǎn)的鑒定.pdf

1、番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）是布尼亞病毒科（Bunyaviridae）中唯一侵染植物的病毒屬，番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）是番茄斑萎病毒屬中的重要成員。其基因組為負(fù)單鏈RNA(-ssRNA)，分別為S、M和LRNA，其中MRNA編碼移動(dòng)蛋白NSm。NSm能夠激活抗性基因Sw-5b介導(dǎo)的抗性，從而被確定為病毒的無(wú)毒因子。單顯性基因Sw-5b對(duì)番茄斑萎病毒屬病毒具有廣譜抗性，它通過(guò)識(shí)

2、別NSm來(lái)誘導(dǎo)過(guò)敏性壞死反應(yīng)(Hypersensitive response，HR)從而防止病毒入侵。
　　Sw-5b屬于CC-NB-LRR類型的免疫受體蛋白，包括四個(gè)主要結(jié)構(gòu)域:N端結(jié)構(gòu)域(NTD)、CC結(jié)構(gòu)域、NB-ARC結(jié)構(gòu)域和C末端的LRR結(jié)構(gòu)域。本課題組的前期研究表明Sw-5b的NB-LRR結(jié)構(gòu)域可以特異性識(shí)別TSWV NSm蛋白而誘導(dǎo)HR反應(yīng)。為確定Sw-5b NB-LRR結(jié)構(gòu)域中與NSm識(shí)別的重要區(qū)段，本研究將不能識(shí)

3、別TSWV NSm并誘尋HR的感病番茄Heinz0176的Sw-5b NB-LRR與抗性番茄Sw-5b NB-LRR的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行逐一替換，發(fā)現(xiàn)將Heinz0176 Sw-5b的LRR交換到抗性番茄的Sw-5b NB-LRR后不能與NSm產(chǎn)生HR反應(yīng)，而將抗性番茄的Sw-5b的LRR交換到Heinz0176 Sw-5bNB-LRR后卻能與NSm產(chǎn)生HR反應(yīng)，說(shuō)明LRR結(jié)構(gòu)域是Sw-5b NB-LRR與NSm識(shí)別的重要區(qū)段。將兩種NB-

4、LRR的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)二者相似性高達(dá)93.75％,其中LRR區(qū)域的相似性最低。為進(jìn)一步鑒定Sw-5b NB-LRR與NSm識(shí)別的關(guān)鍵氨基酸，依次將Heinz0176 LRR中的差異氨基酸位點(diǎn)交換到抗性番茄Sw-5b NB-LRR的中，將這些突變體與NSm在本氏煙中共表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其中的兩個(gè)突變體不再與NSm產(chǎn)生HR反應(yīng)，還有兩個(gè)突變體與NSm產(chǎn)生的HR反應(yīng)強(qiáng)度減弱。對(duì)這四個(gè)突變體的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，它們的表達(dá)水平與Sw-

5、5b NB-LRR相近，排除了因蛋白不表達(dá)或表達(dá)水平很低而導(dǎo)致不產(chǎn)生HR或HR反應(yīng)強(qiáng)度減弱的可能性。以上結(jié)果說(shuō)明，這四個(gè)位點(diǎn)可能是Sw-5b與TSWV NSm發(fā)生識(shí)別的位點(diǎn)。
　　番茄和TSWV均起源于南美，Sw-5b可能是番茄在TSWV這一選擇壓的作用下不斷發(fā)生進(jìn)化的結(jié)果。為從進(jìn)化角度上探究Sw-5b與NSm的識(shí)別機(jī)制，本研究擴(kuò)增了17種南美野生番茄Sw-5b基因的編碼序列，然后分別將它們克隆到表達(dá)載體并與NSm一起共浸潤(rùn)本氏煙