紅法夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素過程關(guān)鍵技術(shù)的研究.pdf

1、蝦青素(3,3’-二羥基-β,β’-胡蘿卜素-4,4’-二酮)是從河螯蝦外殼,牡蠣和鮭魚中發(fā)現(xiàn)的一種紅色類胡蘿卜素,它具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病作用。隨著對蝦青素需求量逐年加大,而化學方法合成的蝦青素存在一定的安全性問題,所以從微生物(如紅法夫酵母、雨生紅球藻等)中提取天然蝦青素是現(xiàn)今該領(lǐng)域的的熱點研究問題。法夫酵母在發(fā)酵過程中需要消耗大量氧氣用以維持細胞的正常代謝和蝦青素的合成,如果要大幅提高法夫酵母發(fā)酵過程中的蝦青

2、素產(chǎn)量,需要重點解決發(fā)酵過程中酵母細胞對氧的攝取率問題。透明顫菌血紅蛋白(VHb)是一種產(chǎn)自原核生物的氧結(jié)合蛋白,本研究嘗試將透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)轉(zhuǎn)入法夫酵母進行表達,試圖借此提高酵母細胞對氧氣的利用能力,進而達到促進菌體生長和提高產(chǎn)物合成的目的,而生產(chǎn)過程中降低攪拌速度和減少通氣則降低了生產(chǎn)能耗,使得生產(chǎn)成本進一步降低。本研究還嘗試在提取過程中添加適量的天然抗氧化劑(如生育酚)來提高蝦青素的萃取得率,此外,在蝦青素的提取過程

3、中首次引入環(huán)境友好試劑如乳酸和乳酸乙酯。
　　(1)本研究利用RT-PCR技術(shù)分析了不同碳源對法夫酵母中蝦青素合成途徑中的關(guān)鍵酶的影響,發(fā)現(xiàn)不同碳源對細胞中蝦青素合成途徑的各關(guān)鍵酶的誘導作用不同,從而在分子水平上優(yōu)化出了最佳碳源組合。最適碳源條件下,分析了不同溶氧對法夫酵母中關(guān)鍵酶表達的影響,發(fā)現(xiàn)25％溶氧最適合蝦青素的合成。同時,這些現(xiàn)象也在分子層面上解釋了細胞產(chǎn)色素能力和碳源、溶氧等培養(yǎng)條件之間的相互聯(lián)系。
　　(2)本

4、研究構(gòu)建了包含cpc-1啟動子、vgb基因和nos終止子的整合型表達載體pBC-Pcpc-vgb-Tnos,利用該載體,將vgb基因整合到法夫酵母的染色體上。搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果顯示:在含vgb基因的轉(zhuǎn)化子中,其各項指標與對照菌株相比,以色素產(chǎn)量最高的一株B1為例,生物量、蝦青素產(chǎn)量和蝦青素含量分別提高了21％、37％和13％。將獲得的色素高產(chǎn)菌株 B1和C2通過斜面連續(xù)傳五代后,發(fā)現(xiàn)兩株菌產(chǎn)色素能力變化不大,最大降幅只有3.2％,說明該菌

5、株生產(chǎn)性能比較穩(wěn)定,此外,將高產(chǎn)菌株 B1和C2在不含潮霉素的斜面上連續(xù)傳五代后提取基因組DNA,通過PCR擴增 vbg基因進行驗證,B1和C2的傳代菌株都能擴增出大約570bp大小的vgb片段,說明該質(zhì)粒已經(jīng)穩(wěn)定的整合到法夫酵母的基因組DNA上,轉(zhuǎn)化菌株的穩(wěn)定性良好。
　　(3)本研究在酵母細胞破壁和蝦青素萃取過程中加入適量的天然抗氧化劑(抗壞血酸和生育酚),發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高和時間的延長,色素得率比對照組有明顯的提高。而環(huán)境友