顆粒細(xì)胞端粒酶及相關(guān)因子的表達(dá)變化對(duì)卵巢功能及卵裂球的影響.pdf

1、卵巢具有產(chǎn)生卵細(xì)胞和分泌激素的功能。卵巢中的卵泡與卵子發(fā)育成熟、排卵及合成和分泌激素及某些細(xì)胞因子有關(guān)，是調(diào)控女性生殖的關(guān)鍵。顆粒細(xì)胞通過(guò)縫隙連接與卵母細(xì)胞緊密接觸，對(duì)卵泡的形成和發(fā)育，及卵母細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和成熟起重要作用。顆粒細(xì)胞是卵巢合成和分泌抑制素、雌激素和孕激素的主要功能細(xì)胞，有高度分裂增殖的潛能。從原始卵泡生長(zhǎng)啟動(dòng)、閉鎖或排卵到黃體形成，顆粒細(xì)胞在形態(tài)、功能等方面發(fā)生了各種變化。而其增殖、分化、凋亡機(jī)制及其調(diào)控非常復(fù)雜，牽涉到復(fù)雜

2、的分子作用機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)通路。因而研究顆粒細(xì)胞是研究卵巢功能的一個(gè)極好的切入點(diǎn)，而對(duì)體外受精促排卵過(guò)程中獲得的黃素化顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，則是獲得人顆粒細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)研究的較好的實(shí)驗(yàn)方法。
　　 卵巢功能失調(diào)可導(dǎo)致多種婦科內(nèi)分泌疾病及不孕。因而調(diào)節(jié)卵巢功能、促排卵以及不孕癥的相關(guān)治療在婦科臨床工作中具有重要意義。年齡增長(zhǎng)和/或卵巢功能下降，可以導(dǎo)致卵泡閉鎖加劇，促排卵時(shí)卵巢反應(yīng)性差，獲得的卵母細(xì)胞少，且卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，卵裂

3、球質(zhì)量差，助孕后妊娠率低下。目前激素類藥物雖廣泛使用，并取得了顯著的療效，但仍有其局限性和副作用，特別是對(duì)年齡小而卵巢功能衰退者，其促排卵效果不好。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子p53、p19ARF、Rb和p16在HRO軸衰老中協(xié)同變化，而預(yù)防性應(yīng)用何首烏飲可通過(guò)抑制性腺軸中衰老途徑的關(guān)鍵因子而起到抗衰老的作用，何首烏飲能改善下丘腦-垂體-卵巢軸的功能。然而，何首烏飲是否以卵巢顆粒細(xì)胞為靶點(diǎn)，直接影響卵巢功能尚無(wú)充分證據(jù)

4、。
　　 顆粒細(xì)胞的凋亡與卵泡閉鎖有關(guān)，而端粒酶活性及相關(guān)因子的表達(dá)變化在顆粒細(xì)胞的凋亡過(guò)程中可能起重要作用，其對(duì)卵巢功能、卵裂球的發(fā)育的影響還不十分清楚。通過(guò)電耦相連的顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間的聯(lián)系，可能代表了一種重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路。顆粒細(xì)胞的去極化是卵母細(xì)胞成熟的重要特征。顆粒細(xì)胞電活動(dòng)的調(diào)節(jié)為研究其細(xì)胞功能提供了一種新方法。鉀離子通道是目前發(fā)現(xiàn)的亞型數(shù)目最多的一類細(xì)胞膜離子通道，在調(diào)控細(xì)胞動(dòng)作電位的形成、膜復(fù)極化、維持靜息電

5、位的水平以及在細(xì)胞的分泌等一系列細(xì)胞生理活動(dòng)方面起著重要作用。鉀離子通道在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化等中的研究較多，而在人卵巢顆粒細(xì)胞上的研究較少，并與顆粒細(xì)胞功能有何聯(lián)系尚不十分清楚。
　　 基于上述，本研究第一部分從進(jìn)行體外受精患者的卵泡液中分離黃素化顆粒細(xì)胞，TRAP-ELISA、RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)方法測(cè)定端粒酶的活性及凋亡相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，探討端粒酶與凋亡相關(guān)因子對(duì)卵巢功能和卵裂球的影響；第二部分則在以前研究的基礎(chǔ)

6、上，為了深入了解何首烏飲對(duì)卵巢自身功能的影響，以體外培養(yǎng)的SD大鼠排卵前卵泡顆粒細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，血清藥理學(xué)的方法為給藥手段，TRAP-ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot觀察何首烏飲對(duì)顆粒細(xì)胞端粒酶活性、凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白的影響，探討何首烏飲對(duì)其干預(yù)作用；第三部分基于少量人卵巢顆粒細(xì)胞上鉀離子通道表達(dá)的研究現(xiàn)狀，應(yīng)用：RT-PCR方法證實(shí)人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞存在電壓門控鉀離子通道m(xù)RNA的表達(dá)，并用化學(xué)發(fā)光法、MTT法、流

7、式細(xì)胞術(shù)、分光光度法分析其被選擇性阻滯劑4-氨基吡啶阻滯后，對(duì)顆粒細(xì)胞分泌及增殖、凋亡的影響，以期對(duì)顆粒細(xì)胞功能調(diào)控與卵泡發(fā)育、閉鎖及卵母細(xì)胞成熟等生理、病理學(xué)問(wèn)題提供一些理論基礎(chǔ)，對(duì)不孕癥的診斷和防治提供新思路。
　　 第一部分人黃素化顆粒細(xì)胞端粒酶活性及凋亡相關(guān)基因、蛋白的表達(dá)變化對(duì)卵巢功能及卵裂球的影響
　　 目的:探討人黃素化顆粒細(xì)胞端粒酶的活性、凋亡相關(guān)基因bcl-2和p53及蛋白的表達(dá)與相應(yīng)卵巢反應(yīng)性和卵裂球

8、發(fā)育的關(guān)系。
　　 方法: 收集行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）患者卵泡液中的黃素化顆粒細(xì)胞（GCs）28例，并進(jìn)行體外培養(yǎng)；根據(jù)卵泡數(shù)不同將卵巢反應(yīng)性分組分為：低反應(yīng)組、中反應(yīng)組和高反應(yīng)組；根據(jù)優(yōu)質(zhì)卵裂球（胚）率進(jìn)行卵裂球質(zhì)量分組分為：低質(zhì)量組和高質(zhì)量組。端粒重復(fù)序列擴(kuò)增酶聯(lián)免疫吸附分析法（TRAP-ELISA）測(cè)定顆粒細(xì)胞端粒酶活性；免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)顆粒細(xì)胞bcl-2和p53蛋白表達(dá)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR

9、）測(cè)定顆粒細(xì)胞bcl-2 mRNA和p53mRNA表達(dá)。分析人黃素化顆粒細(xì)胞端粒酶的活性、bcl-2和p53蛋白及mRNA表達(dá)與卵巢反應(yīng)性及相應(yīng)卵裂球發(fā)育的關(guān)系。
　　 結(jié)論:
　　 1.體外培養(yǎng)的人黃素化顆粒細(xì)胞存在端粒酶活性的表達(dá)。
　　 2.黃素化顆粒細(xì)胞端粒酶活性與年齡、Gn量呈負(fù)相關(guān)，與獲卵數(shù)呈正相關(guān)，提示端粒酶活性降低與卵巢功能的下降有關(guān)。優(yōu)質(zhì)卵裂球率與端粒酶活性有明顯的相關(guān)性，顆粒細(xì)胞的凋亡可能影響

10、卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能。
　　 3.凋亡相關(guān)基因bcl-2、p53及蛋白的表達(dá)與卵巢反應(yīng)性和卵裂球發(fā)育有明顯的相關(guān)性，并與端粒酶活性之間具有相關(guān)性。Bcl-2及p53基因可能參與調(diào)節(jié)端粒酶活性的表達(dá)，可作為我們研究端粒酶活性與卵巢功能關(guān)系的一座橋梁。
　　 第二部分何首烏飲含藥血清對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞端粒酶活性及凋亡相關(guān)蛋白的影響
　　 目的:何首烏飲是具有抗衰老作用的方劑。其療效和對(duì)下丘腦-垂體-卵巢軸的調(diào)節(jié)效應(yīng)已被

11、以往的實(shí)驗(yàn)研究所證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)擬從卵巢顆粒細(xì)胞水平入手，了解中藥何首烏飲體內(nèi)代謝產(chǎn)物在調(diào)節(jié)卵泡微環(huán)境過(guò)程中所起的作用，探討其對(duì)卵泡生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟與閉鎖的調(diào)控機(jī)制。
　　 方法:用外源性激素孕馬血清促性腺激素制備排卵前卵巢模型，收集顆粒細(xì)胞，經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后，分別與雌性SD幼鼠空白血清及含不同劑量何首烏飲的藥物血清在體外共同培養(yǎng)。TRAP-ELISA方法分析顆粒細(xì)胞端粒酶活性；運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析顆粒細(xì)胞凋亡、壞死情況；Western b

12、lot檢測(cè)顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bcl-2，bax的蛋白表達(dá)情況；分光光度法檢測(cè)顆粒細(xì)胞caspase-3活性。
　　 結(jié)論:
　　 1.何首烏飲含藥血清可上調(diào)離體培養(yǎng)的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞端粒酶活性，并抑制自身的凋亡。
　　 2.何首烏飲含藥血清可增加顆粒細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制基因bcl-2蛋白表達(dá)，減少促凋亡基因bax蛋白表達(dá)，這可能是其抑制顆粒細(xì)胞凋亡，防止卵泡閉鎖的作用機(jī)制之一。
　　 3.何首烏飲含藥血清可下

13、調(diào)顆粒細(xì)胞caspase-3蛋白的表達(dá)，其可能是在凋亡的較早階段，通過(guò)阻斷caspase-3的級(jí)聯(lián)裂解發(fā)揮凋亡抑制作用。
　　 4.對(duì)卵泡局部微環(huán)境的調(diào)節(jié)，可能是何首烏飲調(diào)整下丘腦-垂體-卵巢軸功能的作用靶點(diǎn)之一。
　　 第三部分電壓門控鉀離子通道對(duì)人黃素化顆粒細(xì)胞孕酮分泌及增殖凋亡的影響
　　 目的:用RT-PCR方法證實(shí)人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞存在電壓門控鉀離子通道（Kv）mRNA的表達(dá)，分析其阻滯劑4-氨基吡啶

14、（4-AP）對(duì)人絨毛膜促性腺激素（hCG）誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞分泌及增殖、凋亡的作用，探討Kv對(duì)顆粒細(xì)胞功能的影響。
　　 方法:收集25例行體外受精患者卵泡液中的黃素化顆粒細(xì)胞，采用RT-PCR檢測(cè)顆粒細(xì)胞中Kv mRNA的表達(dá)。將培養(yǎng)貼壁后的顆粒細(xì)胞按干預(yù)方式分為空白組、4-AP組、hCG組和hCG+4-AP組共4組，hCG和4-AP的終濃度分別為1250 IU/L、5 nmol/L。培養(yǎng)24 h后，采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定各組培養(yǎng)液孕

15、酮水平；采用流式細(xì)胞術(shù)和分光光度法，以膜連蛋白Ⅴ（annexinⅤ）/碘化吡啶（PI）和caspase-3活性為檢測(cè)指標(biāo)，檢測(cè)各組顆粒細(xì)胞的凋亡情況；采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)各組顆粒細(xì)胞的增殖、抑制情況。
　　 結(jié)論:
　　 1.人黃素化顆粒細(xì)胞存在KV mRNA的表達(dá)。
　　 2.Kv阻滯劑4-AP能夠抑制人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞基礎(chǔ)及hCG誘導(dǎo)下的孕酮的分泌。
　　 3.4-AP可抑制顆粒細(xì)

16、胞的增殖，促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，其抑制顆粒細(xì)胞孕酮分泌可能與其抑制增殖、促進(jìn)凋亡有關(guān)。
　　 4.Kv在卵巢黃素化顆粒細(xì)胞分泌、增殖及凋亡過(guò)程中可能起重要作用。
　　 綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)：（1）體外培養(yǎng)的人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞存在端粒酶活性的表達(dá)；其端粒酶活性、凋亡相關(guān)基因bcl-2及蛋白表達(dá)與卵巢反應(yīng)性、卵裂球的發(fā)育有關(guān)；（2）何首烏飲含藥血清上調(diào)離體培養(yǎng)的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞端粒酶活性，上調(diào)bcl-2蛋白表達(dá)、下調(diào)bax