G-CSF誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞向TH2分化的機(jī)制研究.pdf

1、目的： G-CSF目前被廣泛地應(yīng)用于外周血造血干細(xì)胞移植，盡管在采集物的細(xì)胞中CD3+的細(xì)胞數(shù)增加了十倍，但是嚴(yán)重的急性GVHD的發(fā)生率并沒有增加。G-CSF目前被稱為具有T細(xì)胞免疫耐受作用的免疫調(diào)節(jié)因子(Mediator of T Cell Tolerance)，目前對(duì)G-CSF誘導(dǎo)免疫耐受機(jī)制的研究主要有以下幾個(gè)方面：對(duì)T細(xì)胞影響，rhG-CSF動(dòng)員使Th細(xì)胞向Th2發(fā)生極化，CD4+Th細(xì)胞激活后分化為功能不同的Th1和T

2、h2效應(yīng)細(xì)胞。Th1細(xì)胞分泌[L-2、IFN-γ，TNF-β等，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答、在BMT中介導(dǎo)aGVHD的發(fā)生。Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13等細(xì)胞因子，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，在BMT中和減少aGVHD的發(fā)生有關(guān)。此外對(duì)T細(xì)胞增殖、分化、凋亡均有影響。目前仍需闡明的問題G-CSF的作用是直接作用于T細(xì)胞還是通過其他細(xì)胞因子間接的作用?G-CSF作用下，影響T細(xì)胞向TH2分化的原因有哪些?G-C

3、SF誘導(dǎo)T細(xì)胞向TH2分化是受何種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控?以上問題的解決將為今天通過干預(yù)T細(xì)胞向TH2分化，降低aGVHD的發(fā)生奠定理論基礎(chǔ)。 方法： 本研究采取G-CSF體內(nèi)和體外刺激兩種方式：體外刺激方式時(shí)，抽取健康志愿者外周血，分離單個(gè)核細(xì)胞。CD4細(xì)胞免疫磁珠分離、CD4+T淋巴細(xì)胞，在體外應(yīng)用不同濃度G-CSF刺激，觀測(cè)體外G-CSF對(duì)T淋巴細(xì)胞的直接作用。體內(nèi)研究選取臨床上進(jìn)行骨髓或外用血造血干細(xì)胞移植的供者，在G-C

4、SF動(dòng)員前后采取標(biāo)本，純化CD4+T淋巴細(xì)胞，觀測(cè)G-CSF體內(nèi)刺激對(duì)T細(xì)胞的作用。主要的研究?jī)?nèi)容包括MTT方法檢測(cè)G-CSF對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖和抗原反應(yīng)性的影響，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)檢測(cè)T細(xì)胞的抗原反應(yīng)性。FCM方法檢測(cè)TH1/TH2比率。Real-time PCR檢測(cè)G-CSF刺激淋巴細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的變化。包括G-CSF受體基因(G-CSFR)、CD4+淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的基因(IL-4、IFN-γ)一些分化調(diào)控及轉(zhuǎn)錄因

5、子基因(CD28、CTLA-4、ICOS、GATA3、T-bet、FOXP3)。 結(jié)果： 經(jīng)過CD4免疫磁珠的分離，得到的CD4+T淋巴細(xì)胞純度在95％以上，經(jīng)過G-CSF的刺激，增殖指數(shù)呈時(shí)間依賴性增高。在G-CSF處理之前最低，在G-CS處理后的4-8個(gè)小時(shí)，增殖指數(shù)開始上升，在24-48小時(shí)，增殖指數(shù)達(dá)到高峰，超過72小時(shí)，增殖指數(shù)下降。從LTT的數(shù)值和抑制率的分析K，可以表明G-CSF的刺激可以抑制T細(xì)胞對(duì)PHA

6、的反應(yīng)能力，對(duì)于應(yīng)用G-CSF刺激后的CD4+T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞的LTT值呈下降趨勢(shì)，抑制率呈上升趨勢(shì)。G-CSF住體內(nèi)和體外刺激同樣抑制T淋巴細(xì)胞的抗原反應(yīng)能力，兩組沒有顯著性差異。通過對(duì)體內(nèi)、體外兩組刺激方式下的CD4+T淋巴細(xì)胞的TH1/TH2分析，結(jié)果顯示經(jīng)過G-CSF動(dòng)員，CD4+T淋巴細(xì)胞中分泌IFN-γ的TH1細(xì)胞減少，而分泌IL-4的TH2細(xì)胞增加，動(dòng)員后的TH1/TH2比值顯著降低。在體內(nèi)的刺激還是在體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行G

7、-CSF刺激，對(duì)T細(xì)胞亞群分化的調(diào)節(jié)是沒有差異的。在體外培養(yǎng)的G-CSF刺激下，平均表達(dá)水平升高達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異的基因有IL-4、CTLA-4、GATA3；平均表達(dá)水平降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因是IFN-γ和T-bet。TFN-γ和T-bet基因分別存在顯著相關(guān)性；IL-4和GATA-3基因也存在相關(guān)性。 結(jié)論： 體外G-CSF的刺激可以直接作用于CD4+淋巴細(xì)胞，并使之增殖，但是對(duì)抗原反應(yīng)性降低。體外G-CSF的刺激