柴苓湯對(duì)環(huán)孢素A腎病大鼠a-SMA表達(dá)的影響.pdf

1、CsA腎病是以腎間質(zhì)纖維化為特征的病理改變，表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞外基質(zhì)積聚，小管萎縮和管周毛細(xì)血管缺失，其發(fā)病機(jī)制與血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)、內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)、氧化損傷、醛固酮活化等有關(guān)，其中細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)過(guò)度沉積是腎小管間質(zhì)纖維化的重要特征。大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)在ECM的沉積中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming Grow

2、th Factor-β1，TGF-β1)起著重要的作用，證實(shí)其介導(dǎo)了腎小球的硬化和腎間質(zhì)纖維化。在纖維化的進(jìn)展過(guò)程中，有證據(jù)顯示，腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(tubular epithelial myofibroblast transdifferentiation，TEMT)在腎小管病變、小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，其標(biāo)志蛋白表達(dá)為a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-smooth muscular actin，a-SMA

3、)。
　　 CsA慢性腎毒性屬中醫(yī)學(xué)“水腫”、“腰痛”、“虛勞”、“淋證”等疾病范疇。藥毒傷腎，肝郁氣滯，脾腎虧虛，水濕內(nèi)停是本病的主要病機(jī)特點(diǎn)。治療上應(yīng)利水瀉毒、補(bǔ)益脾腎、疏肝理氣。柴苓湯是小柴胡湯與五苓散的合方，兩方均出自張仲景的《傷寒雜病論》，由柴胡、黃芩、半夏、人參、甘草、生姜、大棗、豬苓、桂枝、白術(shù)、茯苓、澤瀉組成，功能利水瀉毒、疏肝健脾，與CsA腎病的發(fā)病機(jī)制和病變位置藥證合拍。為研究利水瀉毒、疏肝健脾方藥治療CsA

4、腎病的作用機(jī)理、探索古方新用，我們采用CsA慢性腎毒性大鼠模型，觀察利水瀉毒、疏肝健脾中藥柴苓湯及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦對(duì)環(huán)孢素A腎病大鼠TGF-β1、a-SMA及Ⅲ型膠原（collagen typeⅢ，ColⅢ）表達(dá)的影響。研究結(jié)果如下：
　　 實(shí)驗(yàn)一柴苓湯對(duì)環(huán)孢素A腎病大鼠腎功能及病理形態(tài)學(xué)的影響
　　 健康雌性SD大鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、纈沙坦組、柴苓湯組，每組10只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予CsA30mg·

5、kg-1·d-1經(jīng)口灌服，對(duì)照組給予等容量橄欖油，纈沙坦組予纈沙坦10mg·kg-1·d-1，柴苓湯組以柴苓湯3g·kg-1·d-1劑量給藥，自來(lái)水溶解后經(jīng)口灌胃，共28天。每周末將動(dòng)物放入代謝籠中，收集24小時(shí)尿量，并測(cè)體重。所有動(dòng)物于第29天斷頭處死，切取腎臟，常規(guī)制備血清及腎組織石蠟切片標(biāo)本，行HE、Masson染色，觀察腎組織病理學(xué)改變。檢測(cè)血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr)和尿肌酐(Ucr)的含量，計(jì)算肌酐清除率。

6、>　　 結(jié)果顯示：
　　 (1)對(duì)照組大鼠精神狀況、活動(dòng)、毛發(fā)、飲食、飲水、尿量等無(wú)明顯改變。模型組精神萎靡、活動(dòng)差、飲食、飲水量下降、毛發(fā)變黃、松亂、部分脫落。纈沙坦組一般狀況好于模型組。柴苓湯組與纈沙坦組相同。各組大鼠體重在不同時(shí)間對(duì)比無(wú)明顯差異(P＞0.05)。應(yīng)用CsA2周后，模型組的尿量（19.650±9.569ml）比正常對(duì)照組（15.650±2.015）略為增多，但各組間相互比較無(wú)明顯差異。在應(yīng)用CsA3周后，模

7、型組尿量（21.450±8.952）明顯多于正常對(duì)照組（15.400±2.514）(P＜0.05)，但纈沙坦組（17.400±5.854）及柴苓湯組（15.812±7.025）尿量并不增多，和正常對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。4周后，模型組尿量（29.150±13.695）明顯高于正常對(duì)照組（15.800±2.529）及治療組（16.700±4.939，16.734±6.198）(P＜0.01)。
　　 (2)各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)改

8、變：HE染色顯示對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，無(wú)水腫；模型組腎小管上皮細(xì)胞壞死、脫落，間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；纈沙坦組及柴苓湯組小管上皮細(xì)胞水腫、壞死、脫落及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均較模型組為輕。Masson染色結(jié)果顯示對(duì)照組未見(jiàn)異常。模型組結(jié)構(gòu)紊亂，小管間質(zhì)膠原沉積顯著增多。柴苓湯組及纈沙坦組小管間質(zhì)膠原沉積較模型組明顯減少。
　　 (3)各組大鼠尿素氮、血肌酐、肌酐清除率的變化：模型組大鼠尿素氮（11.395±1.824mmol/L）、

9、血肌酐（99.067±5.426μmol/L）較對(duì)照組（6.3450±1.053，79.117±3.511）明顯升高(P＜0.01)，肌酐清除率（0.2823±0.0466ml/min）較對(duì)照組（0.5415±0.0257）明顯降低（P＜0.01）。用藥后，纈沙坦組及柴苓湯組尿素氮（8.615±0.878，7.160±0.679）、血肌酐（87.817±13.189，82.933±9.239）較模型組均明顯降低（P＜0.01），肌酐清除

10、率（0.3428±0.0624，0.3465±0.0383）較模型組明顯升高（P＜0.05）。
　　 實(shí)驗(yàn)二柴苓湯對(duì)環(huán)孢素A腎病大鼠a-SMA表達(dá)的影響
　　 模型復(fù)制、分組、給藥方法同上，共28天。留取腎臟，采用RT-PCR、Western-Blot、免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠腎臟a-SMA蛋白及mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果顯示：
　　 (1)采用RT-PCR測(cè)定a-SMA mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示對(duì)照

11、組大鼠呈弱表達(dá)（0.9177±0.1239），模型組表達(dá)明顯增強(qiáng)（1.1950±0.0467），與對(duì)照組相比有顯著差異(P＜0.01)，柴苓湯組（0.9857±0.0760）及纈沙坦組（1.0503±0.1420）較模型組表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。
　　 (2)Western Blot檢測(cè)腎組織a-SMA蛋白結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠腎組織a-SMA蛋白少量表達(dá)（0.2766±0.1405），模型組表達(dá)顯著增強(qiáng)（0.8788±0.3

12、104），與對(duì)照組相比差異有顯著性（P＜0.01），柴苓湯組(0.5083±0.1092)及纈沙坦組(0.5467±0.0737)a-SMA的表達(dá)較模型組顯著降低。
　　 (3)腎組織a-SMA免疫組化檢測(cè)：光鏡下對(duì)照組僅在血管平滑肌細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，腎小球、腎小管及間質(zhì)未見(jiàn)表達(dá)；模型組a-SMA表達(dá)主要在皮質(zhì)區(qū)及皮髓交界的小管間質(zhì)區(qū)，柴苓湯組及纈沙坦組小管間質(zhì)區(qū)a-SMA表達(dá)較模型組明顯減少。
　　 (4)腎組織a-SM

13、A流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析結(jié)果顯示，a-SMA蛋白表達(dá)定量熒光指數(shù)(FⅠ)模型組（0.9847±0.0065）明顯高于對(duì)照組(0.8197±0.0064)(P＜0.01);柴苓湯組(0.9111±0.0068)及纈沙坦組（0.9131±0.0126）蛋白表達(dá)定量熒光指數(shù)明顯低于模型組(P＜0，01)。
　　 實(shí)驗(yàn)三柴苓湯對(duì)環(huán)孢素A腎病大鼠TGF-β1表達(dá)的影響
　　 模型復(fù)制、分組、給藥方法同上，共28天。留取腎臟，采用RT-

14、PCR、免疫組化檢測(cè)大鼠腎臟TGF-β1蛋白及mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果顯示：
　　 (1)采用RT-PCR檢測(cè)TGF-β1mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠呈弱表達(dá)（0.7927±0.0899），模型組表達(dá)明顯增強(qiáng)（1.1270±0.1239），與對(duì)照組相比有顯著差異(P＜0.01)，柴苓湯組（0.8683±0.0938）較模型組明顯降低(P＜0.05)。
　　 (2)腎組織TGF-β1免疫組化表達(dá)結(jié)果顯示對(duì)照

15、組呈弱表達(dá)。模型組表達(dá)顯著增強(qiáng)，見(jiàn)于腎小管、間質(zhì)及腎小球處，柴苓湯組及纈沙坦組小管間質(zhì)區(qū)TGF-β1表達(dá)較模型組明顯減弱。
　　 實(shí)驗(yàn)四柴苓湯對(duì)環(huán)孢素A腎病大鼠ColⅢ表達(dá)的影響
　　 模型復(fù)制、分組、給藥方法同上，共28天。留取腎臟，采用RT-PCR、Western Blot、免疫組化檢測(cè)大鼠腎臟ColⅢ蛋白及mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果顯示：
　　 (1)采用RT-PCR檢測(cè)ColⅢ mRNA表達(dá)，結(jié)

16、果顯示對(duì)照組大鼠呈弱表達(dá)（0.7630±0.0557），模型組表達(dá)明顯增強(qiáng)（0.9180±0.0593），與對(duì)照組相比差異有顯著性（P＜0.05），柴苓湯組（0.8107±0.0761）及纈沙坦組（0.8300±0.0719）表達(dá)明顯降低。
　　 (2)Western Blot檢測(cè)腎組織ColⅢ蛋白結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠腎組織ColⅢ蛋白少量表達(dá)（0.2129±0.1089），模型組表達(dá)明顯增強(qiáng)（0.7334±0.1396），與對(duì)照

17、組相比差異有顯著性(P＜0.01)，柴苓湯組（0.3337±0.0802）及纈沙坦組（0.4343±0.1997）ColⅢ的表達(dá)較模型組顯著降低(P＜0.01，P＜0.05)。
　　 (3)腎組織ColⅢ免疫組化表達(dá)結(jié)果顯示，對(duì)照組極少量表達(dá)，呈淺黃色。模型組表達(dá)顯著增加，可見(jiàn)棕黃色甚至呈棕褐色染色，柴苓湯組及纈沙坦組小管間質(zhì)區(qū)ColⅢ表達(dá)較模型組明顯減弱。
　　 結(jié)論：
　　 1 柴苓湯對(duì)環(huán)孢素A腎病大鼠的腎組

18、織結(jié)構(gòu)損傷具有明顯的改善作用，可減輕膠原纖維的表達(dá)及纖維化程度，降低血肌酐、尿素氮，升高肌酐清除率，改善腎功能。
　　 2 柴苓湯可下調(diào)CsA所誘導(dǎo)的腎組織a-SMA的高表達(dá)，通過(guò)抑制腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化延緩小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。
　　 3 柴苓湯可抑制CsA腎病大鼠腎組織中TGF-β1mRNA及蛋白的表達(dá)，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程。
　　 4 柴苓湯可下調(diào)CsA腎病大鼠腎組織中ColⅢmR