c-kit與精原干細(xì)胞分化機(jī)制的研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物的生精過(guò)程精細(xì)而復(fù)雜，多種調(diào)節(jié)因素參與生精細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖和分化。精原干細(xì)胞是具有干細(xì)胞活性的生精細(xì)胞，是生精過(guò)程的起始。了解精原干細(xì)胞的分化機(jī)制將有益于揭示生精過(guò)程的起源，有益于人類(lèi)利用精原干細(xì)胞、改造精原干細(xì)胞，從而促進(jìn)醫(yī)學(xué)、生物學(xué)以及畜牧業(yè)的發(fā)展。已證實(shí)：在整個(gè)生精過(guò)程中，生精細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程經(jīng)歷了A0型精原細(xì)胞、A1-A4型精原細(xì)胞、In型（中間型）精原細(xì)胞、B型精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、精子。精原細(xì)

2、胞的各個(gè)亞型細(xì)胞中，僅A0型精原細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，即精原干細(xì)胞，是生精過(guò)程的起始，是一種未分化的精原細(xì)胞，由它而分化出A1-A4精原細(xì)胞及后續(xù)的各種生精細(xì)胞。然而從未分化的精原細(xì)胞分化為A1型精原細(xì)胞是一個(gè)非常很關(guān)鍵的時(shí)期。隱睪、VitA缺乏、Sertoli細(xì)胞中毒、放射損傷都能導(dǎo)致這個(gè)分化步驟的阻斷。然而對(duì)如何調(diào)控未分化精原細(xì)胞的分化、在以上過(guò)程中這個(gè)步驟是如何停滯的還不得而知。C-kit是由原癌基因W locus編碼的跨膜酪氨酸激

3、酶受體，其配體是干細(xì)胞因子（SCF，由sl基因編碼），c-kit受體和它的配體SCF在生精細(xì)胞的發(fā)育和分化過(guò)程中起著重要作用。在缺乏c-kit受體存在的情況下，精原干細(xì)胞無(wú)法分化。有研究表明：未分化的精原細(xì)胞不表達(dá)c-kit，而分化中的精原細(xì)胞有c-kit表達(dá)。精原細(xì)胞從未分化走向分化，c-kit從不表達(dá)走向表達(dá)，這其中c-kit與精原細(xì)胞分化過(guò)程的聯(lián)系成為研究熱點(diǎn)。研究并利用c-kit在精原細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)特點(diǎn)，對(duì)闡明精原細(xì)胞的分

4、化過(guò)程將起重要作用。精原干細(xì)胞具有不對(duì)稱(chēng)分裂的特性，即可向下分化與自我更新，在如何維持精原干細(xì)胞自我更新功能的研究中，plzf的作用引人注目。已證實(shí)plzf缺陷的雄性小鼠出生后會(huì)出現(xiàn)漸進(jìn)性的不育，表現(xiàn)為生精細(xì)胞耗竭，即精原干細(xì)胞自我更新能力缺失。作為一種抑制性的轉(zhuǎn)錄因子，研究plzf在睪丸發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的變化、與代表分化事件的c-kit 表達(dá)水平的對(duì)比，將從新的角度探索精原干細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程。 本課題通過(guò)研究不同發(fā)育階段的大鼠睪丸

5、內(nèi)c-kit在核酸水平、蛋白水平上表達(dá)，探討c-kit 與精原細(xì)胞分化的相關(guān)性；在此基礎(chǔ)上利用c-kit分選出A1-A4型精原細(xì)胞，探討精原細(xì)胞分化比例；研究了與精原細(xì)胞自我更新有重要關(guān)系的plzf表達(dá)，且與c-kit的表達(dá)特點(diǎn)相對(duì)比，揭示未分化精原細(xì)胞走向分化與走向更新之間命運(yùn)選擇特點(diǎn)，并初步探討其機(jī)制。 一、c-kit在發(fā)育中的睪丸內(nèi)的表達(dá)實(shí)驗(yàn)選擇出生后1日齡組、9日齡組、30日齡組雄性SD大鼠，分別使用免疫組化和weste

6、rn-blot檢測(cè)其睪丸內(nèi)c-kit蛋白表達(dá)、RT-PCR半定量檢測(cè)c-kit mRNA表達(dá)，并通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)了9日齡大鼠睪丸細(xì)胞內(nèi)c-kit陽(yáng)性細(xì)胞的比例。結(jié)果如下： 1、c-kit蛋白和mRNA在大鼠睪丸發(fā)育過(guò)程中持續(xù)表達(dá)；表達(dá)位置和水平存在變化，出生后9日左右存在一個(gè)較高的水平表達(dá)，mRNA與蛋白表達(dá)變化一致。 2、根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道精原細(xì)胞發(fā)育的時(shí)相特點(diǎn)，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，9日齡睪丸出現(xiàn)的c-kit表達(dá)增高與精

7、原細(xì)胞在此階段出現(xiàn)大量分化相關(guān)。 3、在9日齡大鼠睪丸中，光鏡下可見(jiàn)的僅有支持細(xì)胞和精原細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)此特定日齡的大鼠睪丸細(xì)胞，結(jié)合此階段的細(xì)胞類(lèi)型，可認(rèn)為：此時(shí)的精原細(xì)胞已出現(xiàn)分化，有（3.16±0.84）％的睪丸細(xì)胞表達(dá)c-kit，即分化的A1-A4 型精原細(xì)胞，為進(jìn)一步分離此亞型細(xì)胞提供了依據(jù)。 以上結(jié)果表明：c-kit表達(dá)與精原細(xì)胞分化關(guān)系密切，精原細(xì)胞分化活動(dòng)增多時(shí)，c-kit的表達(dá)升高，c-kit是

8、精原細(xì)胞分化的標(biāo)志物，其表達(dá)水平可代表精原細(xì)胞分化活動(dòng)的強(qiáng)弱。 二、A1-A4亞型精原細(xì)胞的分選實(shí)驗(yàn)選擇9日齡雄性SD大鼠5只，無(wú)菌取其睪丸兩步法消化成細(xì)胞懸液，percoll不連續(xù)密度梯度分離初步純化出精原細(xì)胞，流式細(xì)胞分選技術(shù)分離出c-kit陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果如下： 1、9日齡大鼠睪丸內(nèi)出現(xiàn)了分化中的精原細(xì)胞，即A1-A4亞型精原細(xì)胞；其含量為（3.16±0.84）％。 2、通過(guò)percoll不連續(xù)密度梯度分離，

9、A1-A4亞型細(xì)胞含量可增加至（18.65±1.69）％，起到了明顯的純化作用。 3、以c-kit為標(biāo)志通過(guò)流式細(xì)胞分選，可成功分離出A1-A4亞型細(xì)胞，分離后的細(xì)胞活性良好，形態(tài)正常。 以上結(jié)果表明：選擇合適日齡動(dòng)物，以percoll不連續(xù)密度梯度純化精原細(xì)胞，再以c-kit作為標(biāo)志物，通過(guò)流式細(xì)胞分選技術(shù)可成功分離A1-A4亞型精原細(xì)胞，為亞型精原細(xì)胞體外純化策略探索了條件、提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 三、精原干細(xì)胞增

10、殖與分化的調(diào)節(jié)因素選擇出生后1日齡、10日齡、30日齡雄性SD大鼠，RT-PCR、western-blot檢測(cè)其睪丸內(nèi)plzf表達(dá)水平，并與同日齡組c-kit表達(dá)特點(diǎn)相對(duì)比，結(jié)果如下： 1、plzf在發(fā)育中的大鼠睪丸內(nèi)有表達(dá)，1日齡睪丸中出現(xiàn)較高水平表達(dá)，隨日齡增加，plzf表達(dá)水平降低。 2、對(duì)比c-kit的表達(dá)情況，可知，在9日齡之前，c-kit表達(dá)隨日齡增加而增加，plzf隨日齡增加而下降；9日齡之后，c-kit與

11、plzf表達(dá)水平均有下降。 3、從1日齡到9日齡，plzf表達(dá)明顯下降，同時(shí)c-kit表達(dá)明顯升高，與此相對(duì)的發(fā)育過(guò)程是精原細(xì)胞增殖減少，而分化增多，反應(yīng)出plzf參與維持干細(xì)胞自我復(fù)制，抑制分化的功能特點(diǎn)。 以上結(jié)果表明：Plzf與精原細(xì)胞保持干細(xì)胞活性，即維持自我更新密切相關(guān)；c-kit與精原細(xì)胞分化密切相關(guān)，兩者在精原細(xì)胞發(fā)育方式的選擇中起著重要作用；plzf與c-kit表達(dá)的水平代表了精原細(xì)胞發(fā)育的方向，為今后體

12、外調(diào)節(jié)精原細(xì)胞發(fā)育、人工干預(yù)生精過(guò)程提供了恰當(dāng)?shù)陌悬c(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 結(jié)論: 1、c-kit在精原細(xì)胞分化過(guò)程中起重要作用，是精原細(xì)胞分化的標(biāo)志，其表達(dá)水平可代表精原細(xì)胞分化活動(dòng)的強(qiáng)弱；以c-kit為標(biāo)志可成功分離A1-A4 亞型精原細(xì)胞。 2、plzf在精原細(xì)胞自我更新中起重要作用，一定時(shí)期內(nèi)與c-kit表達(dá)水平相反，其表達(dá)水平可代表精原細(xì)胞自我更新活動(dòng)的強(qiáng)弱。 3、本文為進(jìn)一步研究精原細(xì)胞發(fā)育方式的體外調(diào)