初級感覺神經(jīng)元的分泌和胞吞：單個囊泡行為的全內(nèi)反射顯微成像(TIRFM)研究.pdf

1、位于背根神經(jīng)節(jié)（DRG）的初級感覺神經(jīng)元表達多種神經(jīng)肽，這些神經(jīng)肽從神經(jīng)元的末梢和胞體等區(qū)域的致密囊泡（DCV）分泌出來，起到調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸傳遞，細胞興奮性和調(diào)控基因表達等重要作用。分泌過程是神經(jīng)肽行使其功能的重要調(diào)節(jié)步驟，然而以往對于這一過程的研究主要在神經(jīng)內(nèi)分泌細胞上進行，對神經(jīng)元神經(jīng)肽分泌多采用生化方法檢測，不足以闡明這一精細調(diào)控的過程。因此我們采用實時成像的方法對DRG神經(jīng)元神經(jīng)肽分泌的調(diào)控進行了研究。在此過程中，我們還意外地發(fā)

2、現(xiàn)了一個內(nèi)吞的負向調(diào)控因子，于是我們進一步對其作用機制進行了研究。本論文將分別對這兩部分工作進行介紹。
　　第一部分研究DRG神經(jīng)元神經(jīng)肽分泌的調(diào)控。我們首次將全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRFM）成像應(yīng)用于DRG神經(jīng)元，用NPY‐pHluorin作為分子標記，在單個囊泡水平觀察刺激引起的神經(jīng)肽分泌。TIRFM記錄到的單囊泡分泌事件有NPY‐pHluorin“完全釋放型”和“不完全釋放型”兩種，提示DRG神經(jīng)元中神經(jīng)肽的分泌受到融合小孔

3、（fusion pore）的調(diào)節(jié)。對胞體和軸突的同時記錄發(fā)現(xiàn)，除了我們已知的胞體分泌，DRG神經(jīng)元的軸突各部分也存在刺激依賴的DCV分泌，兩者對于刺激的響應(yīng)均表現(xiàn)出較長的延遲。去極化及電刺激引起的軸突囊泡分泌的數(shù)量顯著多于胞體，分泌時程也顯著快于胞體，盡管軸突的內(nèi)鈣濃度并不比胞體更高，說明DCV在不同細胞區(qū)域的分泌位點受到嚴格的調(diào)控。然而激活DRG神經(jīng)元上的溫度敏感通道TRPV1引起的神經(jīng)肽分泌在軸突和胞體間沒有明顯的差異，其單個事件的

4、動力學與去極化引起的分泌有顯著的不同，有更多的不完全釋放型的事件發(fā)生。這一發(fā)現(xiàn)表明不同的生理刺激可以對分泌的位點和融合小孔進行調(diào)節(jié)，進而調(diào)節(jié)遞質(zhì)的分泌。
　　第二部分研究DRG神經(jīng)元內(nèi)吞的調(diào)控機制。內(nèi)吞過程的精確和有效的調(diào)控對于突觸傳遞，細胞膜平衡，細胞膜表面的通道和受體的平衡等都具有重要的作用。目前對于囊泡循環(huán)已有大量研究，多集中于發(fā)現(xiàn)促進囊泡快速有效回收的分子機制上，而我們意外地發(fā)現(xiàn)了一個負調(diào)節(jié)機制，我們認為這樣的負調(diào)節(jié)機制能

5、提高囊泡回收的精準性。在研究synaptotagmin-11（syt11）在DRG神經(jīng)元中的功能時，我們發(fā)現(xiàn)它的knockdown（KD）顯著加速了dynamin依賴的刺激偶聯(lián)的內(nèi)吞，而沒有影響分泌。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，syt11 KD的神經(jīng)元中，clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞和巨內(nèi)吞這兩種主要囊泡回收機制的發(fā)生頻率都有增加，同時也組成型的內(nèi)吞也被加速。另外在海馬神經(jīng)元中，syt11也同樣抑制了內(nèi)吞過程，說明它對內(nèi)吞的調(diào)控可能普遍存在于神經(jīng)元