溶血磷脂酸活化初級(jí)感覺神經(jīng)元參與膽汁淤積性瘙癢癥及其機(jī)制研究.pdf

1、慢性瘙癢癥是一種臨床常見的、有時(shí)令人難以忍受的自覺癥狀，通常伴隨著多種系統(tǒng)性疾病的發(fā)生，例如:慢性肝膽系統(tǒng)疾病、慢性腎功能衰竭、惡性腫瘤、全身性感染、多種內(nèi)分泌及血液系統(tǒng)疾病等。近些年以來，隨著人們生活水平的提高，大家對(duì)慢性瘙癢癥的關(guān)注度越來越高，相關(guān)領(lǐng)域的研究也逐年增加。最近發(fā)現(xiàn)了一些特異性的瘙癢神經(jīng)通路，包括一些新的瘙癢介質(zhì)以及它們的一些相應(yīng)受體，但是，慢性瘙癢癥的具體發(fā)病機(jī)制仍然不是十分清楚，故一直找不到行之有效的治療方法。

2、>　　近年來，脂質(zhì)代謝功能障礙是臨床研究的一個(gè)重點(diǎn)和熱點(diǎn)。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)在脂質(zhì)代謝過程中，作為一種重要的中間產(chǎn)物，正越來越受到人們的關(guān)注，其主要由血小板、脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等分泌，在多種疾病中，通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。最近，Kremer等的研究發(fā)現(xiàn)在慢性膽汁淤積性瘙癢患者的血清中，找到了一種新型的致癢介質(zhì)溶血磷脂酸(LPA)，其異常升高已被證實(shí)為引起慢性膽汁淤積性

3、瘙癢的一個(gè)重要原因。又有研究表明，有一類特異性表達(dá)在小鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的肥大細(xì)胞相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體A3（Mas-Related G-coupled Protein Receptor，MRGPRA3）與化學(xué)性瘙癢有密切關(guān)系，該受體激動(dòng)劑為氯喹。MRGPRA3陽性神經(jīng)元與常規(guī)的組胺依賴性瘙癢行為密切相關(guān)。盡管這類傷害性感受器在介導(dǎo)急性瘙癢刺激中發(fā)揮了一定作用，但是仍然不清楚在慢性膽汁淤積性瘙癢病理情況下，這類神經(jīng)元的興奮性是否發(fā)生改變。

4、經(jīng)過以上推論，我們可以假設(shè)，在膽汁淤積性瘙癢癥中，LPA可能激活了癢覺特異性MRGPRA3陽性神經(jīng)元，通過與其中的某型LPA特定受體相結(jié)合，從而使相關(guān)神經(jīng)元興奮性增加，產(chǎn)生自發(fā)性搔抓行為。
　　在本研究的實(shí)施過程中，我們首先使用雄性C57小鼠建立膽總管結(jié)扎模型，觀察BDL手術(shù)后，在不同的時(shí)間點(diǎn)，小鼠自發(fā)性搔抓行為次數(shù)的改變。然后，原代培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion，DRG)神經(jīng)元，在給予LPA刺激后，觀察

5、LPA對(duì)小直徑DRG神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度的改變，以及對(duì)細(xì)胞膜興奮性的改變。接著，使用分子生物學(xué)方法研究參與LPA致癢的受體分型，并使用相應(yīng)基因敲除小鼠進(jìn)一步確認(rèn)LPA與受體的相互作用。最后，使用MRGPRA3轉(zhuǎn)基因小鼠，通過在體電生理實(shí)驗(yàn)方法，明確LPA與MRGPRA3陽性神經(jīng)元相關(guān)的細(xì)胞作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.膽汁淤積性小鼠自發(fā)性瘙癢的搔抓次數(shù)增加
　　動(dòng)物行為學(xué)結(jié)果顯示，隨著膽總管結(jié)扎時(shí)間的延長，與對(duì)照組小鼠相

6、比，膽汁淤積型小鼠在膽總管結(jié)扎術(shù)術(shù)后出現(xiàn)一定次數(shù)的自發(fā)性瘙癢行為，在術(shù)后第10天，1小時(shí)內(nèi)膽汁淤積癥誘發(fā)的自發(fā)性瘙癢抓撓行為達(dá)到峰值，然后開始逐漸下降，并觀察到第14天結(jié)束。
　　2.LPA增加小直徑神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子水平與細(xì)胞膜興奮性
　　分別對(duì)假手術(shù)組與BDL組模型小鼠的DRG神經(jīng)元進(jìn)行原代培養(yǎng)，通過使用鈣成像技術(shù)（鈣離子成像的比率計(jì)），分別比較在LPA刺激后，不同模型組間DRG小直徑神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子對(duì)LPA反應(yīng)性改變的差

7、異，我們發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組小鼠的DRG小直徑神經(jīng)元相比，膽總管結(jié)扎手術(shù)組小鼠的DRG小直徑神經(jīng)元中的陽性反應(yīng)細(xì)胞，所引起的鈣離子反應(yīng)幅度的增加比例更高，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　而且，假手術(shù)組小鼠的DRG小直徑神經(jīng)元對(duì)LPA有反應(yīng)的陽性細(xì)胞數(shù)百分比大約為21.2％左右，相反，對(duì)于膽總管結(jié)扎手術(shù)組小鼠的DRG小直徑神經(jīng)元，其對(duì)LPA有反應(yīng)的陽性細(xì)胞數(shù)百分比顯著增加，達(dá)到46.2％左右，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　以上這些結(jié)果可以

8、說明，與假手術(shù)組相比，在膽總管結(jié)扎術(shù)后，LPA能引起小鼠DRG神經(jīng)元中介導(dǎo)傷害性感覺的小直徑神經(jīng)元對(duì)LPA有反應(yīng)的陽性細(xì)胞比例增加，胞內(nèi)鈣離子反應(yīng)幅度也增加，且增加的鈣離子部分是由于胞外的游離鈣進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)所引起的。
　　局部使用LPA能夠使DRG小直徑神經(jīng)元的靜息膜電位（RMP）引起明顯放電，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而且，細(xì)胞膜去極化能夠使這些有反應(yīng)的神經(jīng)元誘發(fā)動(dòng)作電位(AP)放電。在LPA處理的過程中，平均輸入電阻（Rin）顯著降

9、低，基強(qiáng)度降低，2倍基強(qiáng)度誘發(fā)的動(dòng)作電位數(shù)量增加，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明靜息離子通道的開放增加。以上結(jié)果表明，LPA能直接激活膽總管結(jié)扎模型組小鼠的初級(jí)感覺神經(jīng)元。
　　3.LPA通過LPA4型受體增加搔抓行為、胞內(nèi)鈣離子水平與細(xì)胞膜興奮性
　　使用Real-time PCR法來檢測(cè)BDL術(shù)后小鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)中不同亞型的溶血磷脂酸受體(LPAR1-6)的表達(dá)水平。PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組小鼠相比較，BDL術(shù)后1

10、0天小鼠LPAR4型受體mRNA表達(dá)水平明顯升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然而LPAR1-3，5，6型受體并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。
　　對(duì)LPAR4基因敲除小鼠進(jìn)行同樣的膽總管結(jié)扎術(shù)操作，與野生型小鼠相比較，LPAR4基因敲除小鼠在膽總管結(jié)扎術(shù)后的第10天到第14天，自發(fā)性瘙癢搔抓行為計(jì)數(shù)明顯減少。局部使用LPA刺激LPA4-/-的小直徑神經(jīng)元，與假手術(shù)組相比，膽總管結(jié)扎組LPA4-/-小鼠的DRG小神經(jīng)元對(duì)LPA反應(yīng)陽性的百分比顯著

11、降低，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而且，與野生組小鼠相比，LPA引起的LPA4-/-組小鼠小神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子反應(yīng)的陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)目和增加幅度均顯著減弱。我們又發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，LPA引起LPA4基因敲除小鼠靜息膜電位的去極化明顯減弱，平均輸入電阻(Rn)增加，基強(qiáng)度增加，兩倍基強(qiáng)度誘發(fā)的動(dòng)作電位數(shù)目減少。
　　4.LPA通過LPA4介導(dǎo)MRGPRA3癢覺神經(jīng)元參與的膽汁郁積癥性瘙癢癥
　　使用MrgprA3+轉(zhuǎn)基因小鼠，原代培

12、養(yǎng)神經(jīng)元，局部使用LPA能引起膽總管結(jié)扎模型組小鼠MrgprA3陽性神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子反應(yīng)顯著性增加。通過在體電生理技術(shù)，局部使用LPA能引起B(yǎng)DL組MrgprA3+神經(jīng)元興奮性增加。
　　綜上所述，通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)膽汁淤積性小鼠自發(fā)性瘙癢的搔抓次數(shù)增加。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)LPA與LPA4受體特異性結(jié)合，局部使用能夠增加神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子反應(yīng)的陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)目、反應(yīng)幅度和細(xì)胞膜的興奮性，LPA所致的膽汁淤積性瘙癢癥中部分是由氯喹參與的