感覺(jué)神經(jīng)調(diào)控大鼠牙發(fā)育內(nèi)穩(wěn)態(tài)的機(jī)制研究.pdf

1、內(nèi)穩(wěn)態(tài)（homeostasis）[1]即內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，早期特指機(jī)體內(nèi)環(huán)境的理化性質(zhì)處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，如細(xì)胞外液、組織液、血液和淋巴的量在機(jī)體中處于相對(duì)恒定的狀態(tài)。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，內(nèi)穩(wěn)態(tài)的概念得到了擴(kuò)展，可以指機(jī)體、器官、組織以及細(xì)胞通過(guò)神經(jīng)-體液-免疫系統(tǒng)共同作用，保持各種生理過(guò)程處于協(xié)調(diào)和穩(wěn)定的狀態(tài)。在組織和器官發(fā)育和維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)（homeostasis）的過(guò)程中，干細(xì)胞（stem cells）能夠通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)整其增殖和分化，形成高

2、度精確的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，如表皮、血液和小腸上皮中的干細(xì)胞能夠不斷分化出新的細(xì)胞，補(bǔ)充在正常組織更新（tissue turnover）中損失的細(xì)胞，這一過(guò)程稱(chēng)為維持組織或器官的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。牙齒的形態(tài)發(fā)生和生長(zhǎng)發(fā)育是神經(jīng)嵴源性上皮與外胚間充質(zhì)相互作用的結(jié)果[2]，其發(fā)育模式（patterning）[3]在牙胚發(fā)育啟動(dòng)時(shí)期已經(jīng)確定，因此牙胚是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的發(fā)育單元，其內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)控機(jī)制近年來(lái)逐漸成為口腔研究學(xué)者的關(guān)注熱點(diǎn)。最近的一些研究發(fā)現(xiàn)[4]牙胚發(fā)育

3、早期，神經(jīng)源性信號(hào)分子可以調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、遷移及分化；此外還發(fā)現(xiàn)[5]，神經(jīng)相關(guān)的膠質(zhì)細(xì)胞不僅能夠定向分化為牙髓和成牙本質(zhì)細(xì)胞，還在下切牙的損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。然而神經(jīng)在維持牙齒發(fā)育內(nèi)穩(wěn)態(tài)的具體作用尚不甚清楚。嚙齒動(dòng)物的下頜切牙根尖區(qū)上皮和間充質(zhì)細(xì)胞不斷進(jìn)行更新，使下切牙能夠終身不斷生長(zhǎng)，是研究牙齒內(nèi)穩(wěn)態(tài)的理想模型[6,7]。大量處于休眠期的上皮源性干細(xì)胞位于下切牙根頸環(huán)部分根尖蕾（apical bud）中；而間充質(zhì)來(lái)

4、源的牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）則主要分布在牙髓組織中[8]。大鼠下切牙主要受感覺(jué)神經(jīng)纖維——下牙槽神經(jīng)(IAN)，和交感神經(jīng)纖維——頸上神經(jīng)節(jié)(SCG)發(fā)出的節(jié)后纖維支配[9,10]。因此，明確哪類(lèi)神經(jīng)在牙發(fā)育中起主要支配作用將有助于我們更好的理解感覺(jué)神經(jīng)和交感神經(jīng)在維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)和組織再生修復(fù)中的作用，目前未見(jiàn)明確的神經(jīng)調(diào)控牙齒內(nèi)穩(wěn)態(tài)相關(guān)機(jī)制的報(bào)道。本研究擬通過(guò)建立單側(cè)大鼠下切牙失感覺(jué)和失交感神

5、經(jīng)模型，觀察牙的形態(tài)和組織學(xué)變化，進(jìn)而檢測(cè)失神經(jīng)后大鼠牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)行為，以期明確神經(jīng)能夠通過(guò)調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的行為影響下切牙的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而分析神經(jīng)維持牙齒內(nèi)穩(wěn)態(tài)的相關(guān)信號(hào)通路，探討神經(jīng)調(diào)控牙內(nèi)穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制，以期為研究神經(jīng)維持組織器官內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用模式提供研究基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分失神經(jīng)大鼠模型下切牙的形態(tài)組織學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：明確感覺(jué)神經(jīng)和交感神經(jīng)在維持大鼠下切牙內(nèi)穩(wěn)態(tài)中的作用。方法：建立失右側(cè)感覺(jué)神經(jīng)

6、(IANx)模型，失右側(cè)交感神經(jīng)（SCGx）模型和失右側(cè)感覺(jué)和交感神經(jīng)（IANx+SCGx）模型，同時(shí)設(shè)立假手術(shù)（Sham）組，2周后觀察下切牙形態(tài)學(xué)變化， Micro-CT和組織學(xué)染色檢測(cè)下切牙結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：成功建立失感覺(jué)神經(jīng)模型（截?cái)嘞卵啦凵窠?jīng)）和失交感神經(jīng)模型（以上瞼下垂作為手術(shù)成功指征）；2周后， IANx組和IANx+SCGx組失神經(jīng)側(cè)下切牙發(fā)生明顯不透光的白堊色改變；Micro-CT檢測(cè)顯示，與Sham組相比，IANx組和

7、IANx+SCGx組下切牙髓腔中出現(xiàn)團(tuán)塊狀不規(guī)則高密度影，釉質(zhì)和牙本質(zhì)厚度均減少（P＜0.01），兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而SCGx組無(wú)明顯變化；HE和Masson染色顯示IANx組和IANx+SCGx組右側(cè)下切牙牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)紊亂，髓腔內(nèi)出現(xiàn)髓石，成牙本質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死，同時(shí)釉質(zhì)和牙本質(zhì)形成不全，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，SCGx組與Sham組無(wú)明顯差異；免疫組化染色顯示IANx組和IANx+SCGx組下切牙生發(fā)中心-根尖蕾結(jié)構(gòu)中Pc

8、na表達(dá)顯著減弱，此外，免疫組化和免疫熒光染色顯示，成牙本質(zhì)細(xì)胞層 Dsp表達(dá)明顯降低，而 SCGx組無(wú)明顯變化。結(jié)論：截?cái)喔杏X(jué)神經(jīng)可以明顯影響牙齒形態(tài)結(jié)構(gòu)的形成，提示感覺(jué)神經(jīng)在大鼠下切牙生長(zhǎng)發(fā)育內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮了主要作用，而交感神經(jīng)無(wú)明顯作用。
　　第二部分感覺(jué)神經(jīng)維持大鼠牙髓干細(xì)胞生物學(xué)性能的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：檢測(cè)及分析失感覺(jué)神經(jīng)后大鼠牙髓干細(xì)胞rDPSCs的生物學(xué)性能。方法：分別分離和培養(yǎng)失感覺(jué)神經(jīng)(IANx)2周后

9、的 rDPSCs和假手術(shù)（Sham）2周后的rDPSCs，采用流式細(xì)胞儀和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)干細(xì)胞表面分子標(biāo)記物；計(jì)算克隆形成率比較克隆形成能力，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；進(jìn)行成骨、成脂的觀察和定量分析，同時(shí)通過(guò)qRT-PCR比較兩種細(xì)胞成骨、成脂分化相關(guān)基因的表達(dá)水平；使用細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)兩組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：分離培養(yǎng)的IANx組和Sham組rDPSCs能夠陽(yáng)性表達(dá)MSC的標(biāo)記物CD105和CD29，而不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物C

10、D45，此外還表達(dá)神經(jīng)源性標(biāo)記物GFAP；IANx組和Sham組rDPSCs均具有克隆形成能力和增殖能力，但I(xiàn)ANx組rDPSCs的克隆形成率（8.61±0.62％）遠(yuǎn)低于Sham組（16.22±0.49%）（P＜0.05），且增殖能力弱于Sham組（P＜0.05）；IANx組和Sham組rDPSCs都具有向成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞分化的能力，Sham組rDPSCs的成骨成脂能力均顯著高于IANx組（P＜0.05）；檢測(cè)IANx組rDPSCs

11、的細(xì)胞凋亡率（11.35±0.93%）明顯高于Sham組（6.22±1.05%）（P＜0.001）。結(jié)論：IANx組和Sham組rDPSCs均具有間充質(zhì)干細(xì)胞的自我更新和多向分化能力，但I(xiàn)ANx組rDPSCs的生物學(xué)性能明顯受損，提示感覺(jué)神經(jīng)在維持rDPSCs的正常生物學(xué)行為中發(fā)揮了重要作用，且這種作用不受細(xì)胞傳代的影響。
　　第三部分感覺(jué)神經(jīng)維持大鼠牙髓干細(xì)胞生物學(xué)性能的相關(guān)Wnt/β-Catenin信號(hào)通路機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

12、>　　目的：探討Wnt/β-Catenin信號(hào)通路在rDPSCs生物學(xué)行為中的作用，以期明確感覺(jué)神經(jīng)維持大鼠下切牙內(nèi)穩(wěn)態(tài)中的具體機(jī)制。方法：qRT-PCR檢測(cè)第二部分IANx組和Sham組rDPSCs中Wnt/β-Catenin信號(hào)通路相關(guān)分子β-Catenin、Gsk-3β、Dkk1、Lrp5、Sfrp1和Wnt10a的基因表達(dá)水平；Western Blot檢測(cè)兩組細(xì)胞Wnt/β-Catenin信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白β-Catenin和Gs

13、k-3β蛋白的表達(dá)水平；設(shè)置假手術(shù)組（Sham組）、失感覺(jué)神經(jīng)組（IANx組）和失感覺(jué)神經(jīng)組+激活劑氯化鋰（LiCl）組（IANx+ LiCl組），qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞Wnt/β-Catenin信號(hào)通路的表達(dá)水平；培養(yǎng)液中添加激動(dòng)劑LiCl，激活失感覺(jué)神經(jīng)rDPSCs的Wnt/β-Catenin信號(hào)通路后，檢測(cè)其克隆形成能力、增殖能力、多向分化能力和細(xì)胞凋亡水平，并與IANx組和Sham組進(jìn)行比較。結(jié)果：

14、qRT-PCR結(jié)果顯示，較Sham組rDPSCs，IANx組中Wnt10a表達(dá)量降低，抑制分子Dkk1的表達(dá)水平明顯升高，關(guān)鍵分子β-Catenin和Gsk-3β的基因表達(dá)量均無(wú)明顯差異；Western Blot檢測(cè)示，較Sham組rDPSCs，IANx組中關(guān)鍵分子active-β-Catenin和p-Gsk-3β的蛋白表達(dá)量均降低，但總蛋白量無(wú)明顯差異，提示失感覺(jué)神經(jīng)后，rDPSCs的Wnt/β-Catenin信號(hào)通路受到抑制；qRT

15、-PCR和Western Blot結(jié)果表明，LiCl處理后能激活細(xì)胞的Wnt/β-Catenin信號(hào)通路，但尚不能使之恢復(fù)至正常水平；IANx+ LiCl組的克隆形成率（13.49±1.16%）明顯升高，介于Sham組（16.22±0.86%）和IANx組（8.62±1.07%）之間（P＜0.05），增殖能力和成骨成脂分化能力均有一定程度回升（P＜0.05），同時(shí)，細(xì)胞凋亡率（8.29±0.94%）較 IANx組（11.35±0.93%