MiRNA-646在脂多糖處理后的A549細(xì)胞中的表達(dá)及功能分析.pdf

1、背景：
　　 急性呼吸窘迫綜合征(Acute respi ratory distress syndrome，ARDS)是指膿毒癥、重癥肺炎、多發(fā)傷等肺內(nèi)外疾病侵襲機(jī)體后出現(xiàn)的炎性因子大量釋放，肺泡上皮細(xì)胞損傷及肺表面活性物質(zhì)合成減少為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。其臨床特征包括呼吸頻速和呼吸窘迫，進(jìn)行性低氧血癥，X線呈現(xiàn)彌漫性肺浸潤(rùn)影。雖然治療手段在不斷增加，但ARDS現(xiàn)在仍是PICU中威脅人類生命的重要原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)每年有19

2、萬(wàn)的ARDS病人，死亡率高達(dá)39.4％;而我國(guó)的死亡率更高，達(dá)到71.4％?，F(xiàn)階段ARDS的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，但是在ARDS時(shí)肺表面活性物質(zhì)合成是減少的。Schmidt等發(fā)現(xiàn)在ARDS患者的肺泡灌洗液中肺表面活性蛋白A(surfactant associated protein A，SP-A)、肺表面活性蛋白B(surfactant associated protein B，SP-B)、肺表面活性蛋白C(surfactantasso

3、ciated protein C，SP-C)、二棕櫚酰卵磷脂明顯減少，隨著ARDS的好轉(zhuǎn)，它們的量相應(yīng)的增加。在嚴(yán)重的ARDS病人給予SP-C后，能夠明顯的減輕缺氧，減少死亡率。
　　 microRNA(miRNA)廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)miRNA具有廣泛的基因調(diào)節(jié)功能，它能對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡及關(guān)鍵蛋白的分泌等各個(gè)層面進(jìn)行調(diào)節(jié)。多種miRNA在同一個(gè)細(xì)胞中的表達(dá)使得細(xì)胞處在一

4、種內(nèi)在的miRNA環(huán)境中，這個(gè)環(huán)境控制著成千上萬(wàn)的編碼基因的mRNA，使得各種蛋白的表達(dá)處在一個(gè)合適的水平，調(diào)控各種關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　 現(xiàn)階段人們?cè)絹?lái)越重視miRNA和肺部疾病的關(guān)系的研究，人們已經(jīng)對(duì)miRNA和肺的生長(zhǎng)發(fā)育、肺纖維化、肺部腫瘤、肺部炎癥等方面進(jìn)行了研究，并且證實(shí)了miRNA參與了上述的生命活動(dòng)。ARDS的發(fā)病機(jī)制仍未完全明了，缺乏有效的治療手段，miRNA在ARDS發(fā)生發(fā)展過程中的作用越來(lái)越引起人們的重視

5、。miRNA機(jī)制的研究可能是基因、蛋白水平有關(guān)ARDS/ALI發(fā)病機(jī)制及治療研究的重要補(bǔ)充。目前對(duì)ARDS發(fā)病機(jī)制方面的報(bào)道很少涉及miRNA，ARDS時(shí)在miRNA水平有什么變化？我們通過miRNA芯片檢測(cè)損傷前和損傷后的A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)的miRNA。我們進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miRNA的靶基因和肺表面活性相關(guān)蛋白、肺的生長(zhǎng)發(fā)育、炎癥、細(xì)胞凋亡、腫瘤等方面相關(guān)。我們選擇了和肺表面活性相關(guān)蛋白相

6、關(guān)的miRNA-646(miR-646)進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討miR-646在實(shí)驗(yàn)中的變化，預(yù)測(cè)miR-646的靶基因，進(jìn)一步完善ARDS的發(fā)病機(jī)制，為ARDS的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 目的：
　　 1.檢測(cè)A549細(xì)胞通過脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)處理前后SP-A、SP-C表達(dá)量的變化。
　　 2.通過微陣列芯片技術(shù)測(cè)定LPS處理A549細(xì)胞前后miRNA的差異表達(dá)譜，確定進(jìn)行

7、下面實(shí)驗(yàn)的差異表達(dá)的目標(biāo)miRNA和目標(biāo)靶基因。
　　 3.探討miRNA參與ARDS發(fā)生發(fā)展過程中可能的機(jī)制，為ARDS的診治尋找新的靶點(diǎn)。
　　 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，對(duì)照組是以RPMI-1640培養(yǎng)液處理A549細(xì)胞24小時(shí);實(shí)驗(yàn)組分別以5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml的LPS處理A549細(xì)胞24小時(shí)。通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色、western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中的SP-A、

8、SP-C的表達(dá)量。并用RT-PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞中SP-A、SP-C的mRNA的表達(dá)量。
　　 2.利用miRNA基因芯片檢測(cè)10μg/ml的LPS處理前后A549細(xì)胞，找出其中差異表達(dá)大的miRNA。利用生物信息學(xué)軟件(TargetScan，miRanda，Clip-seq，miRDB)預(yù)測(cè)差異表達(dá)大的miRNA的靶基因，找到一個(gè)靶基因蛋白在ARDS發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用的目標(biāo)靶基因，確定目標(biāo)miRNA和目標(biāo)靶基因。并用

9、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)各組細(xì)胞中目標(biāo)miRNA的表達(dá)量，驗(yàn)證基因芯片的準(zhǔn)確性。并做目標(biāo)miRNA的表達(dá)和目標(biāo)靶基因蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析。
　　 3.體外驗(yàn)證目標(biāo)miRNA對(duì)目標(biāo)靶基因蛋白的的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)分為五組，分別為mock組、miRNA mimics組、miRNA mimics control組、miRNA inhibitor組、miRNA inhibitor control組。mock組轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞時(shí)候加miR

10、NA mimics，不加轉(zhuǎn)染劑;余各組轉(zhuǎn)染時(shí)候A549細(xì)胞液分別轉(zhuǎn)染miRNA mimics、miRNA mimicscontrol、miRNA inhibitor、miRNA inhibitor control。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后做實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證各組細(xì)胞中目標(biāo)miRNA的表達(dá)量，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。最后用western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中的靶基因蛋白的表達(dá)量。
　　 結(jié)果：
　　 1.各組細(xì)胞中SP-A、SP-C的

11、表達(dá)量
　　 1.1 LPS處理前A549細(xì)胞形態(tài)為多角形，胞質(zhì)飽滿，有胞質(zhì)突起，呈貼壁生長(zhǎng)，長(zhǎng)滿時(shí)融合成片，無(wú)核固縮的現(xiàn)象。LPS處理細(xì)胞24 h后，A549細(xì)胞形念變圓，體積縮小，胞質(zhì)變空亮，且胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不等的顆粒。
　　 1.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)各組A549細(xì)胞SP-A、SP-C的表達(dá)量SP-A在對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量是0.0754±0.0009，在5μg/ml脂多糖處理組的相對(duì)表達(dá)量是0.0707±0.001

12、9，在10μg/ml脂多糖處理組的相對(duì)表達(dá)量是0.0424±0.0028，在15μg/ml脂多糖處理組的相對(duì)表達(dá)量是0.0155±0.0019，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=534.498，P＜0.05)。SP-C在對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量是0.0508±0.0035，在5μg/ml脂多糖處理組的相對(duì)表達(dá)量是0.0268±0.0035，在10μg/ml脂多糖處理組的相對(duì)表達(dá)量是0.0148±0.0025，在15μg/ml脂多糖處理組

13、的相對(duì)表達(dá)量是0.0226±0.0035，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=68.388，P＜0.05)。
　　 1.3 western blot檢測(cè)各組A549細(xì)胞SP-A、SP-C的表達(dá)量LPS處理細(xì)胞24 h后western blot檢測(cè)SP-A的表達(dá)量實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組均下降，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且隨著脂多糖濃度的增加，SP-A的表達(dá)量越低，呈現(xiàn)藥物濃度依賴性。western blot檢測(cè)SP-C的表達(dá)量實(shí)驗(yàn)

14、組較對(duì)照組均下降，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，10μg/ml脂多糖處理組SP-C的表達(dá)量最低。
　　 1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞SP-A、SP-C的mRNA的表達(dá)量SP-A的mRNA在對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量是1.0509±0.0368，在5μg/ml脂多糖處理組的相對(duì)表達(dá)量是0.9333±0.0146，在10μg/ml脂多糖處理組的相對(duì)表達(dá)量是0.5630±0.0097，在15μg/ml脂多糖處理組的相對(duì)表達(dá)量是0.2

15、636±0.0248，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=676.753，P＜0.01)。SP-C的mRNA在對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量是1.0442±0.1559，在5μg/ml脂多糖處理組的相對(duì)表達(dá)量是0.5039±0.0175，在10μg/ml脂多糖處理組的相對(duì)表達(dá)量是0.2306±0.0574，在15μg/ml脂多糖處理組的相對(duì)表達(dá)量是0.3987±0.0084，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.635，P＜0.01)。

16、
　　 以上結(jié)果表明在實(shí)驗(yàn)組中各組細(xì)胞的SP-A、SP-C的表達(dá)量較對(duì)照組均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，這和在臨床上ARDS時(shí)SP-A、SP-C的表達(dá)是一致的。
　　 2.芯片結(jié)果和確定目標(biāo)miRNA、靶基因
　　 2.1 miRNA芯片檢測(cè)結(jié)果顯示:篩選出處理前后2倍以上表達(dá)差異的miRNAs:表達(dá)顯著上調(diào)的有31個(gè)，其中表達(dá)差異最大的兩個(gè)為miR-646、miR-1247-3p，miR-646差

17、異達(dá)3.4倍，miR-1247-3p差異達(dá)3.2倍;顯著下調(diào)的有13個(gè)，其中表達(dá)差異最大的兩個(gè)為miR-4455、miR-374b-5p，miR-4455下調(diào)至0.32倍，miR-374b-5p下調(diào)至0.36倍。并用TargetScan，miRanda，Clip-seq，miRDB對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。4個(gè)軟件預(yù)測(cè)miR-646共有512個(gè)靶基因，其中四個(gè)軟件共有的靶基因有176個(gè)。在共有靶基因中發(fā)現(xiàn)一個(gè)候選靶基因?yàn)閟f

18、tpc，它編碼的蛋白為SP-C。SP-C在ARDS發(fā)病過程中起重要作用。所以確定進(jìn)行下面實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)miRNA為miR-646，確定目標(biāo)靶基因蛋白為SP-C。
　　 2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-646的表達(dá)量結(jié)果顯示對(duì)照組miR-646的表達(dá)量是0.9597±0.020，5μg/ml脂多糖處理組的相對(duì)表達(dá)量是1.6319±0.1325，10μg/ml脂多糖處理組的相對(duì)表達(dá)量是2.4762±0.1380，1

19、5μg/ml脂多糖處理組的相對(duì)表達(dá)量是1.6642±0.0938。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，其中10μg/ml組的相對(duì)表達(dá)量最高。這和miRNA芯片結(jié)果是一致的，驗(yàn)證了芯片的準(zhǔn)確性。
　　 2.3 對(duì)miR-646的表達(dá)量和SP-C的表達(dá)量的相關(guān)性分析:脂多糖處理A549細(xì)胞后，miR-646的表達(dá)量和SP-C的表達(dá)量有顯著相關(guān)性(P＜0.05)，并且呈明顯的濃度依賴的負(fù)相關(guān)（pearson相關(guān)系數(shù)r=

20、-0.916）。
　　 3.在體外驗(yàn)證在miR-646對(duì)SP-C的調(diào)控作用
　　 3.1 轉(zhuǎn)染48小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察見到細(xì)胞胞漿中有綠色熒光。收集細(xì)胞后對(duì)各組細(xì)胞做實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示:mock組miR-646的相對(duì)表達(dá)量是256.85±90.12，miR-646 mimics組miR-646的相對(duì)表達(dá)量是194215.66±12555.57，miR-646 mimics control組miR-646的相對(duì)表達(dá)

21、量是145.99±22.40，miR-646 inhibitor組miR-646的相對(duì)表達(dá)量是1.04±0.23，miR-646 inhibitorcontrol組miR-646的相對(duì)表達(dá)量是173.59±15.94。miR-646 mimics組、miR-646 inhibitor組和mock組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功。
　　 3.2 western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)然后各組A549細(xì)胞中SP-C的表達(dá)

22、量。與mock組相比，miR-646 mimics組SP-C的表達(dá)量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與mock組相比，miR-646 inhibitor組SP-C的表達(dá)量明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與mock組相比，miR-646 mimics control組、miR-646 inhibitor control組SP-C的表達(dá)量無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：