x-射線照射后A549細(xì)胞釋放的exosome對同源細(xì)胞及巨噬細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的:
　　放療是治療腫瘤的有效方法之一，但臨床上發(fā)現(xiàn)放療后循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)數(shù)目增加，并通過循環(huán)腫瘤細(xì)胞造成腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。目前認(rèn)為腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體(Tumor DerivedExosome，TD-exosomes)可參與并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但放療后殘存腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體的功能是否發(fā)生改變，即對腫瘤細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞的作用還鮮有報道。本實(shí)驗(yàn)采用A549細(xì)胞釋放的exo

2、some(A549/exo)和X-射線照射A549細(xì)胞株后提取的exosomes(irr-A549/exo)，觀察了其對同源細(xì)胞（即A549細(xì)胞）增殖、遷移及巨噬細(xì)胞Thp-1產(chǎn)生炎癥因子的影響，為放療導(dǎo)致的腫瘤復(fù)發(fā)和遷移提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　方法:
　　1.不同劑量X-射線照射對A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響
　　體外培養(yǎng)A549細(xì)胞株，采用X照射直線加速器進(jìn)行照射，劑量分別為10Gy、20Gy及30Gy，對照組細(xì)胞不進(jìn)

3、行照射。然后將X射線處理后的細(xì)胞分別培養(yǎng)在96孔或6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h，MTS方法觀察A549細(xì)胞增殖;6孔板的細(xì)胞，在繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，部分細(xì)胞采用75％乙醇固定，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期;另外部分細(xì)胞采用AnnexinⅤ/PE及7AAD進(jìn)行標(biāo)記，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。
　　2.exosomes的制備及電鏡觀察
　　收集體外培養(yǎng)的A549及經(jīng)X射線照射72h后A549細(xì)胞的培養(yǎng)上清，差

4、速離心法分離提取exosomes:2000×g，10min;10，000×g，1h;然后將上清超高速110，000×g離心16h，以少量PBS重懸所得沉淀。最后用磷鎢酸負(fù)染exosomes并在透射電鏡下觀察exosomes的形態(tài)，并以Nanodrop進(jìn)行定量。
　　3.A549細(xì)胞經(jīng)X-射線照射后分泌的exosomes(irr-A549/exo)對同源A549細(xì)胞增殖及遷移的影響
　　MTS實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞遷移實(shí)

5、驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)分別觀察A549/exo或 irr-A549/exo兩種不同exosome對A549細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。
　　4.A549/exo或irr-A549/exo對Thp-1產(chǎn)生炎癥因子的影響
　　人單核細(xì)胞Thp-1經(jīng)PMA誘導(dǎo)48 h，使其分化為巨噬細(xì)胞。以A549/exo或irr-A549/exo分別作用于巨噬細(xì)胞12h和24 h，收集培養(yǎng)上清，CBA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子TNF、IL-8、IL-6、I

6、L-10、IL-1β和TGF-β1的表達(dá)情況。
　　5.A549/exo或irr-A549/exo對Thp-1信號分子表達(dá)的影響
　　收集A549/exo或irr-A549/exo刺激12 h及24 h的Thp-1細(xì)胞，采用Western blot檢測NF-κBp65/p-p65及p105/p-p105、p38/p-p38、JNK/p-JNK的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.A549細(xì)胞經(jīng)不同劑量放射線照射后，生

7、長均受到不同程度的抑制，其中30Gy放射線劑量可使A549細(xì)胞在72h內(nèi)的抑制率維持在50％左右;細(xì)胞凋亡率達(dá)20％以上;細(xì)胞周期阻滯在S期。
　　2.電鏡觀察到大小均一的、直徑約為100nm大小的圓形或橢圓形囊泡。
　　3.A549/exo或irr-A549/exo對A549細(xì)胞的增殖均沒有明顯影響;但劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，與空白對照相比，A549/exo可顯著提高A549的遷移率（P＜0.05），irr-A549/exo促A54

8、9橫向遷移的能力更顯著，與空白組及A549/exo刺激組均有顯著差異(P＜0.05，P＜0.01)。Transwell試驗(yàn)也顯示，無論將exosome置于transwell小室的下室，或用exosome處理A549細(xì)胞24h，再將該細(xì)胞加入transwell的上室，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，穿過微孔濾膜的細(xì)胞均增加(P＜0.01)，且irr-A549/exosome促細(xì)胞遷移的能力明顯高于A549/exo(P＜0.05)。
　　4.巨噬細(xì)

9、胞Thp-1經(jīng)A549/exo或irr-A549/exo刺激后，培養(yǎng)上清中IL-1、IL-6、TNF-α及TGF-β的水平顯著增加。
　　5.巨噬細(xì)胞Thp-1經(jīng)A549/exo或irr-A549/exo刺激后12h，Western blot檢測到p-p38活性增加，且irr-A549/exo作用更明顯(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.A549經(jīng)劑量為30Gy的X-射線照射后釋放的exosome，顯著促進(jìn)A549