X-射線照射后4T1腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體對(duì)體內(nèi)外腫瘤增殖、遷移的影響及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：放療是腫瘤治療的有效方法之一，目前約有一半的腫瘤患者依賴(lài)放療。但放療也存在一些問(wèn)題，如單獨(dú)放療很難根除腫瘤，甚至在一些情況下還會(huì)造成腫瘤的播散或轉(zhuǎn)移。某些實(shí)體腫瘤經(jīng)一定劑量的射線照射后，容易發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs），使腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加。CTCs相當(dāng)于腫瘤的“種子”，合適的微環(huán)境對(duì)CTCs的募集及定植至關(guān)重要，而免疫失衡狀態(tài)的微環(huán)境顯然有利于CTCs的定植與生長(zhǎng)。腫瘤來(lái)源的外泌體（tumor deri

2、ved exosomes，TD-exosomes）是由腫瘤細(xì)胞釋放的直徑為30-150nm的內(nèi)吞囊泡，通過(guò)攜帶蛋白質(zhì)、DNA、RNAs及miRNAs等信息分子參與細(xì)胞間的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)以小鼠乳腺癌細(xì)胞系（4T1）及其荷瘤小鼠為模型，觀察4T1細(xì)胞經(jīng)X-射線照射后分泌的外泌體對(duì)4T1生長(zhǎng)和遷移的影響及其對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的作用，并探討4T1經(jīng)X-射線照射后分泌的外泌體對(duì)腫瘤遷移的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.X-射線照射誘導(dǎo)小鼠乳

3、腺癌4T1細(xì)胞凋亡和EMT轉(zhuǎn)化
　　1.1.體外培養(yǎng)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞，采用不同劑量的X-射線（0Gy、10Gy、20Gy、30Gy）照射，24h后收集細(xì)胞，PE-AnnexinV和7-AAD標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)觀察4T1細(xì)胞的凋亡情況。
　　1.2.4T1細(xì)胞經(jīng)不同劑量的X-射線（0Gy、10Gy、20Gy、30Gy）照射，24h后收集細(xì)胞，Western blot檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白Vimentin、N-

4、Cadherin、E-Cadherin。
　　2.X-射線局部照射促進(jìn)4T1荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移
　　取雌性6周齡 Balb/c小鼠，隨機(jī)分為三組，正常對(duì)照組，荷瘤組， X-射線照射荷瘤組。小鼠于右側(cè)第四對(duì)乳腺脂肪墊接種1×106個(gè)4T1細(xì)胞，兩周后, X-射線照射荷瘤組的小鼠接受X-射線（20Gy）照射瘤灶，10天后將所有小鼠處死。
　　稱(chēng)量肺重觀察肺轉(zhuǎn)移情況；取左肺上葉，通過(guò)病理切片、HE染色觀察腫瘤肺轉(zhuǎn)移情況；取右肺，

5、機(jī)械法分離肺組織提取單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)觀察小鼠肺內(nèi) MDSCs（CD11b+Gr-1+）、巨噬細(xì)胞（CD11b+F4/80+）數(shù)。
　　3.X-射線照射的4T1促進(jìn)4T1-GFP增殖
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1細(xì)胞，接受0Gy、10Gy、20Gy、30Gy X-射線照射后，用含0.02％EDTA的胰酶消化，每個(gè)照射劑量組的細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè)/孔，置于6孔板，每組置3個(gè)復(fù)孔。然后每孔加入1×105個(gè)4T1-GFP

6、（帶有綠色熒光）細(xì)胞，48h后，胰酶消化，收集細(xì)胞，每孔細(xì)胞加入一個(gè)流式管，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)4T1-GFP數(shù)量的百分比。
　　4.X-射線照射后4T1細(xì)胞釋放的外泌體對(duì)4T1細(xì)胞增殖、遷移的影響
　　4.1.外泌體的制備及電鏡觀察
　　收集體外培養(yǎng)4T1細(xì)胞及經(jīng)X射線照射后培養(yǎng)72h4T1細(xì)胞的培養(yǎng)上清，差速離心法分離提取外泌體：2000rpm，10min；3000rpm，30min；11000rpm；60min；然后

7、將上清超高速100,000×g離心16 h，以少量PBS重懸所得沉淀。最后用磷鎢酸負(fù)染外泌體并在透射電鏡下觀察 exosomes的形態(tài)，并以Nanodrop進(jìn)行定量。
　　4.2.4T1來(lái)源的外泌體對(duì)體外培養(yǎng)的4T1細(xì)胞增殖、遷移能力的影響
　　通過(guò)實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀（RTCA）、Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量X-射線（0Gy、10Gy、20Gy、30Gy）照射4T1細(xì)胞分泌的外泌體對(duì)4T1細(xì)胞增殖、遷移能力的

8、影響。
　　4.3.Western blot檢測(cè)不同劑量X-射線（0Gy、10Gy、20Gy、30Gy）照射4T1細(xì)胞分泌的外泌體刺激4T1細(xì)胞對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白Vimentin、N-Cadherin、E-Cadherin的表達(dá)。
　　5.X-射線照射后4T1細(xì)胞釋放的外泌體對(duì)小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的影響及其可能的機(jī)制
　　取雌性6周齡Balb/c小鼠，隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組、PBS組、4T1/exo組、ir

9、-4T1/exo組。實(shí)驗(yàn)組的小鼠經(jīng)乙醚麻醉，分別經(jīng)鼻吸入PBS、未經(jīng)X-射線照射4T1分泌的外泌體（4T1/exo）、經(jīng)20Gy劑量的X-射線照射4T1分泌的外泌體（ir-4T1/exo），每周3次，每次60μl，連續(xù)3周。三周后將每組小鼠分成2個(gè)小組。第一小組：取小鼠肺組織；第二小組：經(jīng)尾靜脈給3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小鼠（PBS、4T1/exo和ir-4T1/exo）注射1×105個(gè)4T1細(xì)胞。
　　稱(chēng)量肺重觀察肺轉(zhuǎn)移情況；取左肺上葉，通

10、過(guò)病理切片、HE染色觀察腫瘤肺轉(zhuǎn)移情況。
　　分別取上述不同處理組的小鼠肺組織（左肺下葉，大約0.037g），用勻漿器進(jìn)行組織勻漿，ELISA檢測(cè)肺勻漿液中細(xì)胞因子 CXCL1、IL-1α、G-CSF、IL-10含量。
　　6.X-射線照射前后4T1細(xì)胞分泌的外泌體攜帶的細(xì)胞因子
　　蛋白芯片技術(shù)檢測(cè) X-射線照射前后（0Gy、20Gy）4T1細(xì)胞分泌的外泌體（4T1/exo、ir-4T1/exo）中包含的細(xì)胞因子。<

11、br>　　ELISA驗(yàn)證 X-射線照射前后（0Gy、20Gy）4T1細(xì)胞分泌的外泌體中包含的細(xì)胞因子。
　　7.外泌體刺激小鼠骨髓巨噬細(xì)胞（BMDM）的培養(yǎng)上清對(duì)4T1細(xì)胞增殖和遷移的影響
　　7.1.BMDM細(xì)胞的培養(yǎng)
　　取Balb/c小鼠股骨腔內(nèi)的骨髓細(xì)胞，用完全1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。加入細(xì)胞因子GM-CSF刺激7天，終濃度為50ng/ml，刺激3天后補(bǔ)一次刺激因子。
　　7.2.外泌體刺激BMDM細(xì)胞48h

12、，收集培養(yǎng)上清，通過(guò)實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀（RTCA）、Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察該上清對(duì)4T1細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。ELISA檢測(cè)外泌體刺激BMDM細(xì)胞后培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子CXCL1、IL-1α、G-CSF含量的變化。
　　7.3.外泌體刺激BMDM細(xì)胞對(duì)M1、M2相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　體外培養(yǎng)BMDM細(xì)胞，經(jīng)外泌體刺激48h，收總蛋白，Western blot檢測(cè)外泌體刺激BMDM細(xì)胞對(duì)IKappaB、IKK

13、a表達(dá)的影響。
　　7.4.外泌體刺激對(duì)BMDM細(xì)胞的p38MAPK信號(hào)分子的影響
　　體外培養(yǎng)BMDM細(xì)胞，經(jīng)外泌體刺激48h，收總蛋白，Western blot檢測(cè)外泌體刺激BMDM細(xì)胞對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路分子p38MAPK、p-p38表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.X-射線照射促進(jìn)4T1細(xì)胞凋亡率明顯增高，與未經(jīng)照射的4T1細(xì)胞相比差異顯著（P<0.01），并且20Gy組明顯高于10Gy、30Gy組的凋亡。

14、r>　　2.X-射線可明顯降低荷瘤小鼠原位瘤的重量（P<0.05），但促進(jìn)肺內(nèi)轉(zhuǎn)移灶增多。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，X-射線使小鼠肺內(nèi)MDSCs細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量增多（P<0.01）。
　　3.將4T1-GFP細(xì)胞加入經(jīng)X-射線照射的4T1細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，與未經(jīng)照射或10Gy照射的4T1細(xì)胞相比，經(jīng)20Gy或30Gy照射的4T1細(xì)胞明顯促進(jìn)4T1-GFP細(xì)胞增殖（均為P<0.05）。
　　4.利用差速離心方法得到4T1細(xì)胞分泌的

15、外泌體，通過(guò)磷鎢酸負(fù)染在透射電子顯微鏡下觀察到直徑約在30-150nm的橢圓形顆粒，中間淡染，邊緣深染。
　　5.實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀、Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20Gy劑量的X-射線照射4T1細(xì)胞分泌的外泌體與未照射組分泌的外泌體相比，可明顯促進(jìn)4T1細(xì)胞增殖與遷移（P<0.05）。Western blot結(jié)果顯示30Gy劑量的X-射線照射4T1細(xì)胞分泌的外泌體與其他三組照射劑量組（0Gy、10Gy、20Gy）相比

16、可明顯下調(diào)E-Cadherin表達(dá)（P<0.05）。
　　6.荷瘤小鼠肺重結(jié)果顯示，與未吸入外泌體組相比，吸入外泌體的小鼠肺重明顯增加（P<0.01），且ir-4T1/exo較4T1/exo肺重明顯增加（P<0.01）；肺組織病理切片結(jié)果顯示，ir-4T1/exo較4T1/exo促進(jìn)腫瘤肺轉(zhuǎn)移。ELISA結(jié)果顯示，肺組織勻漿ir-4T1/exo組CXCL1、G-CSF的含量高于4T1/exo組（P<0.01）。
　　7.蛋白

17、芯片技術(shù)結(jié)果顯示，4T1/exo與 ir-4T1/exo相比，細(xì)胞因子RANTES、MCP1、CXCL1含量明顯增高（P<0.05）。而ELISA結(jié)果顯示， ir-4T1/exo中CXCL1的含量高于4T1/exo組（P<0.01）。
　　8.實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀、Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， ir-4T1/exo刺激BMDM細(xì)胞的培養(yǎng)上清與4T1/exo組相比可明顯促進(jìn)4T1細(xì)胞的增殖與遷移（P<0.01）。ELIS

18、A結(jié)果顯示，BMDM細(xì)胞經(jīng)4T1/exo、ir-4T1/exo刺激后的培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子CXCL1、G-CSF、IL-1α含量增多（P<0.01）。
　　9.Western blot結(jié)果顯示外泌體作用BMDM細(xì)胞后NF-κB IKappaB、IKKa表達(dá)無(wú)差異；p38 MAPK磷酸化水平增加。
　　結(jié)論：
　　1.X-射線局部照射可促進(jìn)4T1荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移。
　　2.X-射線照射后4T1細(xì)胞釋放的外泌體對(duì)4T1體