腫瘤來源的外泌體在耐失巢凋亡肝癌細(xì)胞自我種植中的作用及其機制研究.pdf

1、實驗?zāi)康?
　　肝細(xì)胞肝癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其術(shù)后高復(fù)發(fā)率是制約肝癌治療效果的首要因素。其中在循環(huán)系統(tǒng)中耐失巢凋亡的肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞在肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中起到了重要作用。腫瘤細(xì)胞脫落入血已被證實發(fā)生于腫瘤形成的早期，然而，并非所有進(jìn)入循環(huán)的腫瘤細(xì)胞都會形成轉(zhuǎn)移灶，這取決于耐失巢凋亡腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性、定植器官的微環(huán)境及機體的免疫狀態(tài)等因素。本研究的目的就是觀察耐失巢凋亡肝癌細(xì)胞的腫瘤自我種植現(xiàn)象，以及腫瘤來源的外泌體

2、在肝癌細(xì)胞自我種植中的作用及內(nèi)在機制。
　　材料與方法:
　　本研究通過polyHEMA包被的低粘附培養(yǎng)板對正常肝癌細(xì)胞系HuH-7和HCCLM3進(jìn)行長時間連續(xù)懸浮培養(yǎng)后獲得耐失巢凋亡的肝癌細(xì)胞株，通過細(xì)胞增殖實驗，流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡、Transwell實驗等方法，觀察耐失巢凋亡肝癌細(xì)胞株細(xì)胞株的增殖能力、抗凋亡能力、侵襲轉(zhuǎn)移能力等生物學(xué)特性的變化。通過構(gòu)建裸鼠肝癌原位荷瘤模型，觀察耐失巢凋亡的肝癌細(xì)胞在體內(nèi)的腫瘤自我種植現(xiàn)

3、象。在體外通過提取不同組織來源細(xì)胞的分泌物及分泌物不同成分檢測其對耐失巢凋亡肝癌細(xì)胞穿內(nèi)皮細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。在機制上，利用microRNA芯片技術(shù)對不同細(xì)胞來源外泌體中microRNA表達(dá)檢測進(jìn)行檢測，同時對外泌體共培養(yǎng)后耐失巢凋亡肝癌mRNA的表達(dá)譜進(jìn)行檢測，結(jié)合兩者結(jié)果預(yù)測外泌體中mircoRNA對耐失巢凋亡肝癌細(xì)胞穿內(nèi)皮細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的調(diào)節(jié)，并進(jìn)一步通過microRNA干擾技術(shù)在相應(yīng)的耐失巢凋亡肝癌細(xì)胞中進(jìn)行驗證。

4、　　結(jié)果:
　　實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)(1)肝癌細(xì)胞系HuH-7和HCCLM3隨著失巢培養(yǎng)時間的遞增逐漸聚集成團。(2)耐失巢凋亡肝癌細(xì)胞的遷移能力明顯增強而侵襲能力無明顯變化，在失巢環(huán)境中再次分散成單細(xì)胞時耐失巢凋亡細(xì)胞株具有較快聚集成團能力，且抗失巢凋亡能力顯著增強。耐失巢凋亡肝癌細(xì)胞恢復(fù)貼壁培養(yǎng)后細(xì)胞增殖能力無明顯變化。(3)耐失巢凋亡肝癌細(xì)胞通過靜脈注射進(jìn)入肝癌原位荷瘤裸鼠的體內(nèi)28d后可以觀察到腫瘤自我種植現(xiàn)象。(4)腫瘤細(xì)胞來源

5、的分泌物能明顯增強耐失巢凋亡肝癌細(xì)胞的穿內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力。(5)腫瘤細(xì)胞來源的分泌物中外泌體能顯著增強耐失巢凋亡肝癌細(xì)胞的穿內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力，而細(xì)胞因子等其他分泌物作用不明顯。(6)外泌體對耐失巢凋亡細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用是通過細(xì)胞胞吞作用實現(xiàn)的。(7)不同細(xì)胞來源外泌體的microRNA芯片檢測共篩選出20條在HuH-7細(xì)胞外泌體中高表達(dá)的與細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力相關(guān)的microRNA。(8)外泌體共培養(yǎng)后耐失巢凋亡肝癌mRNA的表達(dá)譜進(jìn)行

6、檢測共篩選出17個表達(dá)下調(diào)的基因。(9)腫瘤來源的外泌體中含有的miR-25-5p在調(diào)節(jié)耐失巢凋亡肝癌細(xì)胞穿內(nèi)皮細(xì)胞遷移侵襲能力方面起到了重要作用。(10)外泌體與耐失巢凋亡肝癌共培養(yǎng)后LRRC7表達(dá)下降，應(yīng)用miR-25-5p抑制劑后LRRC7表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　綜上所述，我們通過細(xì)胞失巢培養(yǎng)模型，建立了耐失巢凋亡肝癌細(xì)胞株。這一細(xì)胞亞株在生物學(xué)行為方面與來源的肝癌細(xì)胞系相比發(fā)生了一定的變化。該類細(xì)胞在失巢環(huán)境中細(xì)