LPS誘導(dǎo)下A549細(xì)胞的TMEM16A表達及功能.pdf

1、目的：急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是機體遭受各種誘因嚴(yán)重打擊引起的以肺泡毛細(xì)血管膜通透性增加為特征的肺部炎癥綜合癥。發(fā)病急、病情重，未經(jīng)有效治療可以發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合癥(acuterespiratory distress syndrome，ARDS)。ALI病因與發(fā)病機理復(fù)雜，而肺間質(zhì)與肺泡水腫卻是共同病理表現(xiàn)，說明ALI/ARDS均存在肺水清除障礙。
　　既往有關(guān)ALI/ARDS研究主要集中在肺內(nèi)

2、炎癥過程，近年來對ALI肺水形成與清除過程給予較多關(guān)注，因此與水轉(zhuǎn)運有關(guān)的離子通道研究逐漸活躍。TMEM16A就是TMEM家族中近來受到關(guān)注的與細(xì)胞分泌相關(guān)的新型成員。已初步發(fā)現(xiàn)其在大鼠ALI模型肺泡上皮細(xì)胞中表達明顯增強，且不同誘因所致ALI大鼠模型之間還有差異。因此，有必要進一步探討該蛋白活性與ALI/ARDS肺水清除的關(guān)系。
　　TMEM16A基因，又名TAOS2，DOG1，F(xiàn)LJ10261或ORAOV2，是TMEM家族的一

3、員，已有研究證明在食管癌、膀胱癌和乳腺癌中，感覺神經(jīng)元，上皮細(xì)胞均有表達。于2008年CaputoA等證實該蛋白為鈣激活的氯離子通道，有研究表明其與氣道的粘液腺體分泌相關(guān)。目前認(rèn)為Ⅱ型上皮細(xì)胞(Alveolar epithelial cells typeⅡ，ATⅡ)在肺液清除中起著關(guān)鍵作用，一些研究正在探索肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞上氯離子通道的特點。Yang C近期一項研究提示：Ⅱ型上皮細(xì)胞參與了與尿嘌呤三磷酸腺苷(UTP)相關(guān)的液體分泌，Ro

4、ck JR等研究表明：TMEM16A也參與了與LITP相關(guān)的液體分泌。而TMEM16A作為一種氯離子通道，其在急性肺損傷肺水清除中的作用尚無研究。
　　感染是引起肺損傷和呼吸功能障礙的常見原因，脂多糖(LPS)是細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分，可刺激組織細(xì)胞釋放多種炎性物質(zhì)(包括細(xì)胞因子)、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。臨床資料表明嚴(yán)重感染與ALI/ARDS均有密切關(guān)系，但應(yīng)用不同濃度的LPS刺激肺泡上皮細(xì)胞TMEM16A的表達，國內(nèi)外尚未見明確報道。因此

5、本實驗的目的即：
　　1.檢測脂多糖(LPS)刺激下A549細(xì)胞上清液中TNF-α的濃度，了解其與細(xì)胞損傷程度的關(guān)系。
　　2.檢測A549肺泡上皮細(xì)胞上是否有TMEM16A蛋白的陽性表達，以及觀察不同濃度的脂多糖(LPS)誘導(dǎo)下以A549細(xì)胞TMEM16A蛋白表達水平的差異為進一步探討該蛋白活性與ALI/ARDS肺水清除的關(guān)系提供新的思路和實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.A549細(xì)胞分為對照組和實驗組，實驗組分

6、別用不同終濃度的LPS(5μg/ml；10μg/ml；15μg/ml)處理24h[1-3]；
　　2.MTT法檢測LPS對A549細(xì)胞增殖的影響，電鏡觀察細(xì)胞器的變化；
　　3.采用ELISA法檢測脂多糖(LPS)刺激下A549細(xì)胞上清液中TNF-α的濃度；
　　4.Western blot法檢測對照組和實驗組A549細(xì)胞TMEM16A蛋白表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)及細(xì)胞器變化的結(jié)果

7、　　倒置顯微鏡結(jié)果：對照組：A549細(xì)胞為多角形、橢圓形，胞質(zhì)非常豐富，細(xì)胞突起比較明顯，呈貼壁性生長，并融合成片，基本上無核固縮；實驗組脂多糖處理后(5μg/ml)，A549細(xì)胞的形態(tài)變化與對照組無明顯變化。脂多糖處理后(10μg/ml和15μg/ml)，A549細(xì)胞形態(tài)變圓，體積縮小，胞質(zhì)內(nèi)可出現(xiàn)大小不等的顆粒。電鏡結(jié)果：對照組A549細(xì)胞表面有大量的短小微絨毛，細(xì)胞質(zhì)豐富，內(nèi)有各種細(xì)胞器如線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、板層

8、小體、粘液空泡和微囊等，實驗組脂多糖處理后(5μg/ml)，A549細(xì)胞的細(xì)胞器變化與對照組無明顯變化。脂多糖(10μg/ml和15μg/ml)處理后，A549細(xì)胞表面的微絨毛減少，細(xì)胞內(nèi)可見大量的空泡，線粒體部分嵴和少部分膜融合，模糊不清，可見嵴的缺失現(xiàn)象。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，可見顆粒融合及脫顆?，F(xiàn)象。且隨著脂多糖濃度的增加細(xì)胞器損傷逐漸加重。
　　2.MTT法檢測不同時間不同濃度脂多糖干預(yù)的細(xì)胞生長抑制率較對照組逐漸增加，A5

9、49細(xì)胞的生長抑制率實驗組5μg/ml，10μg/ml，15μg/ml的細(xì)胞生長抑制率逐漸增加，5μg/ml實驗組在脂多糖刺激3小時與6小時后細(xì)胞生長抑制率比較不具有統(tǒng)計學(xué)意義，其余實驗組在任何時間點組間兩兩比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。而在同一時間點，3，12，24小時10μg/ml和15μg/ml實驗組間比較均不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，其余實驗組在同一時間點組間兩兩比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。
　　3

10、.ELISA法檢測結(jié)果顯示實驗組細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α濃度較對照組均明顯增加，而且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。
　　4.Western-blot實驗各組TMEM16A的表達：實驗組5μg/ml(0.3028±0.01898)，10μg/ml(0.2946±0.00535)的TMEM16A的蛋白表達量較對照組(0.2764±0.00814)升高，15μg/ml(0.2190±0.00865)組細(xì)胞的TMEM16A的蛋白表

11、達量較對照組降低，5μg/ml的實驗組升高與對照組總體均數(shù)相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.014)，15μg/ml蛋白表達水平降低比對照組及其他實驗組總體均數(shù)相比均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.001)。
　　結(jié)論：
　　1.脂多糖可以成功誘導(dǎo)A549細(xì)胞的急性損傷；
　　2.對照組及實驗組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α水平在不同濃度，不同時間脂多糖干預(yù)下的TNF-α的水平隨著細(xì)胞損害程度的加重呈逐漸升高趨勢，各實驗組組間變化具有統(tǒng)