納米細菌對人膽囊結(jié)石形成的影響和機制探討.pdf

1、第一章納米細菌與大腸桿菌在膽囊結(jié)石患者體內(nèi)的共生關(guān)系 目的：通過對膽囊結(jié)石中納米細菌和大腸桿菌的分別培養(yǎng)與鑒定，以及對兩菌混合培養(yǎng)后在不同培養(yǎng)條件下的生長狀況，菌液涂片的茜素紅鈣染色情況的分析，及培養(yǎng)上清中的β-葡萄糖醛酸酶的定量分析，以期發(fā)現(xiàn)納米細菌和大腸桿菌在膽囊患者體內(nèi)共同存在、相互作用、協(xié)同促進結(jié)石形成的證據(jù)。 方法：取45例膽囊結(jié)石患者的結(jié)石標本，每例標本分成兩份，任取一份結(jié)石標本進行納米細菌培養(yǎng)，光鏡觀察納米

2、細菌的生長情況，并對培養(yǎng)物采用納米細菌單克隆抗體免疫熒光染色、茜素紅鈣染色、及電鏡下尋找納米細菌的形態(tài)學(xué)證據(jù)，判斷納米細菌在標本中感染狀況；取另一份膽囊結(jié)石患者的結(jié)石標本，進行大腸桿菌的培養(yǎng)與鑒定，判斷大腸桿菌在標本中的感染狀況；計算45例膽囊結(jié)石患者的結(jié)石標本中納米細菌和大腸桿菌的感染率，并對其進行Kappa-致性檢驗，尋找兩者在膽囊結(jié)石形成過程中共生關(guān)系的證據(jù)；進行納米細菌和大腸桿菌混合培養(yǎng)，對培養(yǎng)物采用茜素紅鈣染色及β-葡萄糖醛酸

3、酶的測定，探討納米細菌與大腸桿菌的相互作用以及其機制。 結(jié)果：對45例結(jié)石標本的培養(yǎng)物進行免疫熒光染色，顯微鏡觀察其中有18例感染納米細菌，陽性率為40％；采用茜素紅鈣染色，發(fā)現(xiàn)其中有21例感染納米細菌，陽性率為46.7％。膽囊結(jié)石患者的45例結(jié)石標本中有24例感染大腸桿菌，陽性率為53.3％。膽囊結(jié)石患者的45例結(jié)石標本中有16例的培養(yǎng)物，納米細菌和大腸桿菌檢測都為陽性，Kappa一致性檢驗說明兩者共感染一致率高(P<0.01

4、)。納米細菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)后，培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)白色鈣化樣物質(zhì)，菌液在瓊脂板上傳代培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)菌落周圍有白色粉末顆粒，混合培養(yǎng)菌液涂片發(fā)現(xiàn)部分大腸桿菌茜素紅鈣染色呈陽性(30％±2％)，高于大腸桿菌單獨培養(yǎng)組(P<0.01)；納米細菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)后檢測未發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的β-葡萄糖醛酸酶分泌增加(P>0.05)。 結(jié)論：膽囊結(jié)石患者的結(jié)石中存在著納米細菌感染；膽囊結(jié)石患者的結(jié)石中存在著大腸桿菌感染；納米細菌與大腸桿菌在膽囊

5、結(jié)石中的共感染一致率高，可能共同參與膽囊結(jié)石的形成；免疫熒光試驗和透射電鏡可以幫助鑒定納米細菌；短時間的混合培養(yǎng)后，納米細菌通過直接附著和侵入大腸桿菌的方式引起大腸桿菌發(fā)生生物礦化作用；尚沒有證據(jù)支持納米細菌是通過促進大腸桿菌產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶這條途徑增強其促成石能力。 第二章納米細菌對人膽囊上皮細胞的侵襲作用 目的：在成功分離、培養(yǎng)人膽囊上皮細胞的基礎(chǔ)上，研究納米細菌對人膽囊上皮細胞的侵襲作用。 方法：尋找適

6、宜的方法和合適的體外生長條件，行體外分離、培養(yǎng)及鑒定人膽囊上皮細胞。然后將實驗分為兩組，第一組將納米細菌菌株Se90和人膽囊上皮細胞爬片混合培養(yǎng)，第二組為膽囊上皮細胞爬片空白對照組。光鏡下觀察不同濃度納米細菌攻擊后人膽囊上皮細胞的形態(tài)學(xué)變化；使用四唑鹽(MTT)比色試驗檢測被攻擊后細胞的存活和生長情況；使用免疫熒光染色觀察不同時間點納米細菌于上皮細胞的空間位置關(guān)系；透射電鏡下觀察被納米細菌攻擊后的膽囊上皮細胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 結(jié)

7、果：使用鈍性刮擦法，置于含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5％CO<,2>、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，成功地進行了人膽囊上皮細胞的分離和體外原代培養(yǎng)，并理想貼壁，制作了細胞爬片。納米細菌菌株Se90與人膽囊上皮細胞爬片混合培養(yǎng)后，光鏡下觀察不同濃度納米細菌侵襲細胞爬片后的情況。隨著時間推移，被攻擊的膽囊上皮細胞逐漸出現(xiàn)水腫，分離，隨后細胞破碎，胞核溶解消失，此過程中未發(fā)現(xiàn)明顯凋亡小體形成。將納米細菌和膽囊上皮細胞爬片混合培養(yǎng)，

8、檢測不同時間含不同濃度納米細菌混合培養(yǎng)液的上清液中四唑鹽(MTT)的值，比較48和72小時MMT結(jié)果，稍高濃度組(OD=0.02)吸光度值均明顯低于低濃度組的吸光度值(P<0.01)； 在72小時低濃度組(OD=0.005)比對照組吸光度低，比較差異具有顯著性(P<0.01)，而在48小時該組與對照組比較，差異無顯著性。免疫熒光染色顯示，納米細菌可以在較短時間內(nèi)進入膽囊上皮細胞中，且隨著時間的推移，進入膽囊上皮細胞內(nèi)的細菌逐漸增

9、多，直至進入?yún)R集于胞核。在電鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，膽囊上皮細胞受到納米細菌攻擊以后，細胞表面豐富的微絨毛減少，細胞內(nèi)線粒體腫脹明顯，嚴重情況下細菌侵入細胞內(nèi)部，造成細胞破裂壞死。 結(jié)論：適宜的方法和條件能有效進行膽囊上皮細胞的體外原代培養(yǎng)；納米細菌可以在短時間內(nèi)迅速進入膽囊上皮細胞并對其產(chǎn)生損傷作用，產(chǎn)生從大體形態(tài)到超微結(jié)構(gòu)的一系列改變；且細菌濃度越高，作用時間越長，造成的損傷越嚴重；較短時間內(nèi)(48 小時內(nèi))被攻擊的膽囊上

10、皮細胞大部分的死亡方式是壞死而不是凋亡。 第三章納米細菌損傷人膽囊上皮細胞的機制初步探討 目的：從自由基以及細胞炎性因子的角度初步探討納米細菌對人膽囊上皮細胞的損傷機制。 方法：0.5 Mcfarland 濃度納米細菌攻擊人膽囊上皮細胞以后，分別于不同時間點吸取培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)或RT-PCR方法，進行 LDH，MDA，IL-1β，IL-6的含量檢測。 結(jié)果：檢

11、測結(jié)果顯示納米細菌攻擊膽囊上皮細胞以后，隨著攻擊的時間延長，LDH 活性逐漸升高，72小時內(nèi)各組比較差異具有顯著性(P<0.01)；同時各時間點MDA含量差異除了24小時組與對照組比較差異稍有顯著性，其余各組之間差異無顯著性(P>0.05)；隨著時間延長，IL-6 的表達逐漸增高，至24小時達到高峰，72小時內(nèi)實驗組與對照組各時點間比較差異具有顯著性(P<0.01)；隨攻擊時間延長，IL-1βmRNA 的表達量逐漸升高，1個小時(0.3

12、5±0.03)，6個小時(0.68±0.06)，12個小時(0.91±0.04)，24小時(1.14±0.07)實驗組內(nèi)各個時點之間比較有明顯差異(P<0.01)，而對照組的膽囊上皮細胞IL-1βmRNA未見明顯表達，兩組各時點間比較差異具有顯著性(P<0.01)。 結(jié)論：納米細菌株Se90攻擊人膽囊上皮細胞，能產(chǎn)生大量的IL-1β，IL-6 等細胞因子，直接或者間接地導(dǎo)致細胞損傷。在損傷過程中可能沒有自由基的參與而與大量的細胞