以HERG基因表達模型為基礎(chǔ)的藥物在心臟復極方面的安全性評價.pdf

1、藥物致QT間期延長的副作用已成為威脅公眾用藥安全的重要問題，也是目前藥物安全管理部門和藥物公司廣泛關(guān)注的藥物心臟毒性問題。很多藥物可以通過直接阻斷心肌復極中的快速激活延遲整流鉀通道電流（IKr），使得復極時程延長，導致QT間期延長，甚至發(fā)生尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動過速或心源性猝死；也可以通過干擾鉀通道蛋白的表達，間接減少IKr使得QT延長。藥物對心臟復極的不良影響成為美國食品和藥品管理局（FDA）終止藥品上市的主要原因之一，并要求所有藥物上市

2、前必須進行這方面的評價。對IKr電流的測定成為判斷藥物是否能引起QT延長及是否易產(chǎn)生促心律失常作用的一個指標。因此，本研究擬從細胞離子通道、蛋白水平上建立一套臨床前在體外評價藥物對心臟復極影響的方法，并應(yīng)用藥物進行評估。據(jù)此，本研究設(shè)計了三個分實驗。
　　 第一部分：建立表達HERG基因的HEK293細胞模型，并培養(yǎng)出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HERG-HEK293細胞株；
　　 第二部分：用已知導致QT間期延長的藥物西沙比利來測定該藥

3、對HERG通道電流的影響，進一步明確該通道的特性，并評價西沙比利對HERG通道蛋白的影響；
　　 第三部分：評價我國的一類抗心律失常新藥--鹽酸關(guān)附甲素對HERG通道電流、通道動力學的影響，并對HERG基因F656C突變后的電流進行測定，明確藥物與HERG通道結(jié)合位點；應(yīng)用免疫蛋白印跡技術(shù)（Western blot）評價關(guān)附甲素對蛋白表達的影響。
　　 第一部分：HERG-HEK293細胞表達模型的建立
　　 目

4、的：通過基因轉(zhuǎn)染的方法把HERG基因轉(zhuǎn)染進HEK293細胞，使之表達HERG通道鉀電流及蛋白，達到建立HERG.HEK293細胞表達模型的目的。
　　 方法：利用LipofectamineTM2000將pCDNA3.0-HERG和綠色熒光蛋白（GFP）瞬時轉(zhuǎn)染進入HEK293細胞，利用膜片鉗技術(shù)測定HERG-HEK293細胞上的HERG鉀電流：應(yīng)用G418對瞬時轉(zhuǎn)染的陽性克隆細胞進行篩選，進而利用免疫蛋白印跡技術(shù)（Western

5、 blot）測定2HERG-HEK293細胞的HERG蛋白的表達。
　　 結(jié)果：LipofectamineTM2000介導的瞬時轉(zhuǎn)染成功率在30-70％，該方法有效地將HERG基因轉(zhuǎn)染進入HEK293細胞，并表達HERG介導HERG通道鉀電流；G418可成功篩選HERG基因陽性的克隆細胞，使得瞬時轉(zhuǎn)染的HERG-HEK293細胞達到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，并可用于Western blot的研究。
　　 結(jié)論：熒光顯微鏡檢查、膜片鉗及W

6、estern blot研究證實該HERG-HEK293細胞表達模型的建立成功的。
　　 第二部分：西沙比利對HERG基因表達的快速激活延遲整流鉀通道電流及蛋白的影響
　　 目的：評價西沙比利對轉(zhuǎn)染HERG基因表達的快速激活延遲整流鉀電流（IKr）和蛋白的影響，探討其致心律失常發(fā)生的機制。
　　 方法：使用脂質(zhì)體介導的瞬時轉(zhuǎn)染法把野生型HERG基因轉(zhuǎn)染進人胚腎細胞（HEK293），采用全細胞膜片鉗技術(shù)評價西沙比利對

7、IKr通道電流和動力學的影響；使用G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HERG的細胞，并用西沙比利進行干預，應(yīng)用免疫蛋白印跡技術(shù)（Western blot）評價藥物對蛋白的影響。
　　 結(jié)果：西沙比利對IKr通道的刺激電流（IHERG）和尾電流（Itail）具有濃度和電壓依賴性抑制作用，半數(shù)最大抑制濃度（IC50）分別14.5和3.9 nmol/L。西沙比利使IHERG和Itail的最大峰值電位前移，但不改變激活電位；使激活曲線左移并加快通道

8、的失活，但不改變通道失活后的恢復時間；西沙比利對HERG-HEK293細胞上的IKr通道蛋白無明顯抑制。
　　 結(jié)論：西沙比利通過作用于通道的激活態(tài)及失活態(tài)抑制HERG鉀電流，但不影響HERG通道蛋白的表達，從而使得心肌復極時程延長，導致心律失常發(fā)生。
　　 第三部分：關(guān)附甲素對轉(zhuǎn)染HERG基因表達的快速激活延遲整流鉀通道電流和蛋白的影響
　　 目的：評價關(guān)附甲素（GFA）對HERG基因表達的鉀通道電流和蛋白的影

9、響。
　　 方法：使用脂質(zhì)體介導的瞬時轉(zhuǎn)染法把野生型HERG基因轉(zhuǎn)染入人胚腎細胞（HEK293），使之表達快速激活延遲整流鉀電流（IKr），采用標準的全細胞膜片鉗技術(shù)記錄IKr通道電流，觀察不同濃度的關(guān)附甲素對IKr的影響并進行通道動力學研究。采用定點突變技術(shù)使HERG基因產(chǎn)生F656C突變，并應(yīng)用膜片鉗進行藥物對電流影響的測定。應(yīng)用免疫蛋白印跡技術(shù)（Western blot）評價關(guān)附甲素對HERG鉀通道蛋白的影響。
　　

10、 結(jié)果：
　　 1.關(guān)附甲素對IKr通道的峰電流IHERG具有濃度和電壓依賴性抑制作用，半數(shù)最大抑制濃度（IC50）為465.95μmol/L；400μmol/L和1000μmol/L的關(guān)附甲素使IHERG的最大峰值電位前移，但不改變激活電位。25～400μmol/L的關(guān)附甲素對尾電流（Itail）抑制不明顯，1、2.5和5mmol/L的關(guān)附甲素對抑制率分別為34.9％、58.0％和70.5％，IC50為1.64mmol/L。

11、lmmol/L的關(guān)附甲素對Itail呈電壓依賴性，并使得最大峰值電位前移，電流-電壓曲線的形狀產(chǎn)生變化，但對激活電位沒有影響。關(guān)附甲素對HERG通道電流的抑制無時間依賴性。
　　 2.關(guān)附甲素可以使得通道的激活曲線左移并能加快通道的失活過程，并且能在-60mV的電壓上減慢通道失活后的恢復時間，而對去激活時間常數(shù)無明顯影響。
　　 3.關(guān)附甲素對F656C突變的HERG通道峰電流（IHERG）和尾電流（Itail）具有抑制

12、效應(yīng)，但抑制程度比野生型HERG電流明顯減弱，并使得激活曲線左移。
　　 4.高濃度的關(guān)附甲素可抑制HERG鉀通道蛋白的轉(zhuǎn)運，且對F656C突變表達的HERG鉀通道蛋白抑制更明顯。
　　 結(jié)論：25～400μmol/L的關(guān)附甲素對IKr的抑制作用不明顯，高濃度的關(guān)附甲素可以抑制HERG電流，關(guān)附甲素主要是作用于HERG通道的失活態(tài)和激活態(tài)，并且主要是結(jié)合在HERG通道的S6區(qū)從而抑制鉀電流。關(guān)附甲素不影響HERG蛋白的合