轉(zhuǎn)eGFP基因小鼠環(huán)境釋放安全性評價研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品在逐漸進(jìn)入人們的生活，人們對轉(zhuǎn)基因動物的安全性也日益關(guān)注。目前轉(zhuǎn)基因動物安全性評價策略與方法主要從三個方面入手:轉(zhuǎn)基因動物自身的安全性評價、轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品安全性評價和轉(zhuǎn)基因動物對環(huán)境的安全性評價，轉(zhuǎn)基因動物對環(huán)境方面的安全評價近乎空白。
　　本文以轉(zhuǎn)eGFP基因（enhanced green fluorescent protein，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白）小鼠為研究對象，主要進(jìn)行了:(1)用單線法對其進(jìn)行傳代，獲得轉(zhuǎn)eG

2、FP基因小鼠及其后代共94只，其中F0代6只，F(xiàn)1代8只，F(xiàn)2代19只，F(xiàn)3代22只，F(xiàn)4代39只，用PCR法和熒光蛋白觀察法分別對這些小鼠進(jìn)行檢測，分析轉(zhuǎn)基因動物在傳代過程中外源基因的表達(dá)情況;(2)用半熒光定量PCR技術(shù)(real-time quantitative PCR)對小鼠外源基因在傳代過程中的表達(dá)情況進(jìn)行定量檢測;(3)分別檢測全同胞轉(zhuǎn)基因陰性（對照組）和陽性小鼠個體4周齡和8周齡的腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu)，利用PCR法檢測轉(zhuǎn)

3、基因小鼠的eGFP基因和WRPE原件，分析轉(zhuǎn)基因小鼠腸道微生物是否發(fā)生基因漂移現(xiàn)象，用選擇性培養(yǎng)基對腸道微生物中11種菌群（包括總需氧細(xì)菌、沙門氏菌、大腸桿菌、葡萄球菌、腸球菌、總厭氧細(xì)菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、梭菌、類桿菌、鏈球菌）進(jìn)行分離培養(yǎng)，活菌計(jì)數(shù)，分析轉(zhuǎn)基因小鼠菌群結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化;(4)最后，利用DGGE技術(shù)研究轉(zhuǎn)eGFP小鼠糞便微生物群落結(jié)構(gòu)，對4周齡和8周齡小鼠腸道微生物V3區(qū)的30條和29條特異性條帶進(jìn)行克隆測序。主要研

4、究結(jié)果如下:
　　1.以轉(zhuǎn)eGFP基因小鼠原代為父、母本，用單線法對其進(jìn)行傳代，獲得轉(zhuǎn)eGFP基因小鼠及其后代共94只。PCR法檢測，陽性小鼠為77只，陽性率為81.91％，F(xiàn)0代至F4代陽性小鼠分別為6只、5只、18只、17只和31只，陽性率分別為100.00%、62.50%、94.74%、77.27%和79.49%;熒光蛋白觀察，有綠色熒光的個體為80只，陽性率為85.11%，F(xiàn)0代至F4代陽性小鼠分別為6只、8只、13只、2

5、1只和32只，陽性率分別為100.00%、100.00％、68.42%、95.45％和82.05%?？ǚ綑z驗(yàn)，×2=2.7163，×2＜X20.05(4)，P＞0.05，PCR檢測結(jié)果與綠色熒光性狀觀察結(jié)果差異不顯著(P＞0.05)，說明在本研究中PCR法檢測轉(zhuǎn)基因動物可行;轉(zhuǎn)基因動物采用單線法傳代可行。
　　2.利用半熒光定量PCR檢測F0代轉(zhuǎn)基因小鼠心、肝、脾、肺、腎、盲腸和睪丸中外源基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)eGFP在所有檢測組織

6、中均表達(dá)，其中在心、肝、腎和睪丸中表達(dá)量相對較高，之間差異不顯著(P＞0.05);心臟中表達(dá)量最高，極顯著高于脾臟、肺臟和盲腸（P＜0.01）;在脾臟和盲腸中表達(dá)量相對較低。WRPE原件的表達(dá)情況與eGFP基因趨勢相同。對F0代至F4代小鼠心臟中的外源基因表達(dá)情況進(jìn)行定量檢測，發(fā)現(xiàn)外源基因在F0代小鼠中的表達(dá)量顯著高于F1、F2、F3和F4代小鼠(P＜0.05)，F(xiàn)1至F4代每一代之間均有降低，但差異均不顯著(P＞0.05)，WRPE在

7、不同代（F0、F1、F2、F3和F4代）中的表達(dá)情況與eGFP基因趨勢相同。表明外源基因在傳代過程中的表達(dá)量隨著傳代數(shù)的增加，有不斷降低的趨勢。
　　3.對4周齡和8周齡全同胞陰性（對照組）和轉(zhuǎn)基因陽性小鼠個體糞便微生物菌群活菌計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠個體糞便微生物優(yōu)勢菌群數(shù)量與對照組均差異不顯著(P＞0.05)，表明外源基因?qū)D(zhuǎn)基因動物腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)沒帶來顯著性影響。經(jīng)過PCR檢測，沒有在4周齡和8周齡小鼠的糞便樣品中發(fā)現(xiàn)eGF

8、P基因和WRPE原件，說明在研究時限內(nèi)轉(zhuǎn)基因小鼠腸道沒有檢測到基因漂移現(xiàn)象。
　　4.利用DGGE技術(shù)比較轉(zhuǎn)基因小鼠與對照組小鼠糞便微生物，發(fā)現(xiàn)二者的微生物菌群結(jié)構(gòu)相似;對4周齡和8周齡小鼠腸道微生物V3區(qū)特異性條帶進(jìn)行測序比對，發(fā)現(xiàn)二者具有同樣的優(yōu)勢菌群:厚壁菌(Firmicutes)、桿菌(Bacteroidetes)和放線菌（Actinobacteria），均沒有發(fā)現(xiàn)未知的菌群，說明在研究時限內(nèi)轉(zhuǎn)基因小鼠與對照組小鼠糞便微生