His-tag對hCD59抑制劑ILYd4作用的影響.pdf

1、美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實驗室(Lab for translational research)已研究發(fā)現(xiàn)了一種有效的特異性hCD59的抑制劑:ILYd4(Intermedilysin的第四個結(jié)構(gòu)域),并擁有美國專利。該實驗室前期的一些研究數(shù)據(jù)顯示:ILYd4可以作為一種重要的潛在輔助性藥物,在輔助利妥昔單抗(Rituximab,RTX,美羅華)及Ofatumumab(OFA)治療RTX耐藥的NHL和CLL中發(fā)揮作用。然而,這些文章中所

2、用的ILYd4在N端都存在另外的30個氦基酸序列,其中包含了多聚組氨酸標(biāo)簽(6×His標(biāo)簽)。His標(biāo)簽主要用于金屬同化親和層析抽提純化蛋白。已有研究證明親和標(biāo)記如6×ttis標(biāo)簽會對目標(biāo)蛋白的生物學(xué)活性產(chǎn)生負(fù)面影響,從而降低或者改變它的生物學(xué)活性。為了使ILYd4能更好的應(yīng)用于臨床治療,需要進(jìn)一步研究這些額外的序列是否會影響它的抗hCD59活性。
　　研究目的：
　　1.制備去除6×His標(biāo)簽的ILYd4(tag-free

3、 ILYd4),比較His-tagged和tag-freeILYd4功能性差異,即抗hCD59活性的改變。
　　2.比較His-tagged和tag-free ILYd4的溶解狀態(tài),聚合程度以及熱穩(wěn)定性等物理特性方面的差異,進(jìn)一步解釋功能性差異的可能機制。
　　研究材料與方法：
　　1.制備His-tagged和tag-free ILYd4:用固化金屬離子親和層析法(IMAC)純化蛋白,制備His-tagged ILY

4、d4。根據(jù)His-tagged ILYd4結(jié)構(gòu)上的腸激酶(Enterokinase,EK)靶位去除His標(biāo)簽,冉次層析純化(IMAC)獲得去除了His標(biāo)簽的ILYd4,即non-his ILYd4或tag-free ILYd4。
　　2.比較ttis-tagged和tag-free ILYd4生物學(xué)活性的差異:剛補體介導(dǎo)的溶血試驗鑒定His標(biāo)簽對ILYd4生物學(xué)活性影響。用RTX耐藥的B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞株如ARH-77,RL和RR51

5、.2細(xì)胞株,比較His-tagged和tag-free ILYd4對RTX介導(dǎo)的CDC作用的影響,以判斷功能上的差異。
　　3.溶解狀態(tài)研究:將兩種ILYd4透析于不同的pH緩沖液中(pH:5.0,7.4,9.0),用蛋白質(zhì)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)一步檢測它們?nèi)芙鉅顟B(tài)。
　　4.多聚化程度研究:用10％Native-PAGE膠檢測His-tagged和tag-free ILYd4的聚集狀態(tài)。
　　5

6、.熱穩(wěn)定性研究:將兩種ILYd4蛋白分別放置于室溫25℃和40℃溫浴鍋內(nèi)保存不同時間(1、3、7、14天),用補體介導(dǎo)溶血試驗檢驗它們的生物學(xué)活性;再分別應(yīng)用蛋白質(zhì)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)技術(shù)鑒定它們的溶解狀態(tài)及多聚化程度。
　　研究結(jié)果：
　　1.經(jīng)過酶切和金屬固化親和層析獲得純化tag-free ILYd4。
　　2.補體介導(dǎo)溶血試驗結(jié)果顯示:T

7、ag-free ILYd4的生物學(xué)活性比His-tagged ILYd4的生物學(xué)活性提高了10倍。
　　3.在RTX耐藥的B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞株ARH-77,RL和RamosR51.2中,相比于His-taggedILYd4,Tag-free ILYd4更為有效地提高的RTX介導(dǎo)的CDC作用,共提高了三到四倍。
　　4.在不同的pH條件下(pH5.0,7.4,9.0),Tag-free ILYd4的可溶性和聚集化程度要明顯優(yōu)于Hi

8、s-tagged ILVd4。
　　5.Tag-free ILYd4具有更好的熱穩(wěn)定性。補體介導(dǎo)溶血試驗結(jié)果顯示Tag-freeILYd4在40℃時比His-tagged ILYd4更穩(wěn)定。蛋白質(zhì)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)結(jié)果也說明,His-taggedILYd4會形成與時間和溫度相關(guān)的聚集化。
　　結(jié)論及意義：
　　1.His標(biāo)簽會影響ILYd4的生

9、物學(xué)活性。去除His標(biāo)簽后,ILYd4(tag-free)抗hCD59活性提高。
　　2.His標(biāo)簽會影響ILYd4的物理特性。去除His標(biāo)簽后,ILYd4(tag-free)具有更好的物理特性,具體包括:溶解度增強,聚合程度降低以及具有更好的熱穩(wěn)定性。
　　相對于His-tagged ILYd4,tag-free ILYd4作為一種潛在的輔助用藥,具有更好的臨床應(yīng)用前景。將在治療NHL和CLL,尤其是RTX耐藥的NHL和C