NHE1通過調(diào)節(jié)MT1-MMP介導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)移.pdf

1、乳腺癌是女性惡性腫瘤中最常見的一種,腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者治療失敗和死亡的主要原因,因此深入研究乳腺癌轉(zhuǎn)移的機制無疑是需要迫切解決的一大難題。鈉氫交換蛋白1(Na+/H+exchanger1,NHE1)是在哺乳動物中廣泛表達(dá)的一種整合膜蛋白,它通過交換細(xì)胞內(nèi)的氫離子和細(xì)胞外的鈉離子來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的pH,從而在許多生理和病理過程中都起著至關(guān)重要的作用。大量研究已經(jīng)證實NHE1參與了許多實體瘤的轉(zhuǎn)移,其中包括乳腺癌,但是其詳細(xì)作用機制尚

2、不清楚。
　　 膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1(Membrane type matrix metalloproteinasesl,MT1—MMP)是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族中研究較多的一個成員,它可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分、細(xì)胞粘附分子和激活MMP-2和MMP—13,從而參與細(xì)胞的遷移過程。研究表明MT1-MMP在許多惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào),并且有文獻(xiàn)報道MT1-MMP在乳腺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。
　　 最近的研究發(fā)現(xiàn),

3、NHE1可以通過調(diào)節(jié)一些蛋白酶的活性調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲,例如:cathepsin B、MMP9和MMP2,但是NHE1是否對MT1-MMP有調(diào)節(jié)作用尚未見有報道。
　　 目的:
　　 闡明NHE1在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞的體外遷移和侵襲中的作用,并初步探討其作用機制,為尋找乳腺癌新的治療策略提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.不同濃度的NHE1特異性抑制劑Cariporide處理MDA-

4、MB-231細(xì)胞24小時,采用MTT法檢測Cariporide對細(xì)胞活力的影響,從而確定本實驗中Cariporide的使用濃度。
　　 2.采用劃痕實驗和體外侵襲實驗分別觀察Cariporide對MDA-MB-231細(xì)胞體外遷移能力和侵襲力的影響。
　　 3.分別采用酶譜法、實時定量PCR和免疫印跡法檢測Cariporide對MDA-MB-231細(xì)胞中MT1—MMP的活性及其mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響。
　　

5、4.利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建MT1-EGFP質(zhì)粒,并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞,使其高表達(dá)MT1-MMP。采用劃痕實驗和體外侵襲實驗分別觀察高表達(dá)MT1-MMP的MDA—MB-231細(xì)胞及其用Cariporide處理后的體外遷移能力和侵襲力的變化。
　　 5.采用免疫印跡法檢測:p38 MAPK、ERK1/2和JNK在MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞中基礎(chǔ)磷酸化水平的差異；MDA-MB-231細(xì)胞中,Cariporid

6、e對p38 MAPK、ERK1/2和JNK信號通路的影響。
　　 6.應(yīng)用體外侵襲實驗和免疫印跡法分別檢測用Cariporide、MAPK抑制劑(MEK抑制劑PD98059、p38 MAPK抑制劑SB203580和JNK抑制劑SP600125)及聯(lián)合使用Cariporide和MAPK抑制劑處理MDA-MB-231細(xì)胞后,其體外侵襲力及MT1-MMP蛋白表達(dá)的改變。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT結(jié)果顯示,當(dāng)Car

7、iporide濃度大于或等于60μM時可明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞活力,且呈濃度依賴性。當(dāng)Cariporide濃度小于60μM時MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞活力并不受影響。本實驗選用的Cariporide濃度為20μM。
　　 2.劃痕實驗和體外侵襲實驗結(jié)果顯示,Cariporide處理MDA—MB-231細(xì)胞24小時后,其體外遷移能力和侵襲力均顯著降低,具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.酶譜法結(jié)果顯示Carip

8、oride處理MDA—MB-231細(xì)胞后,pro-MMP2活化為MMP2的量明顯減少,反映了MT1-MMP活性的降低；實時定量PCR和免疫印跡法結(jié)果顯示Cariporide可分別在mRNA和蛋白水平上降低MT1-MMP的表達(dá),且具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 4.劃痕實驗和體外侵襲實驗結(jié)果顯示,與未作任何處理的MDA-MB-231細(xì)胞相比,過表達(dá)MT1-MMP的MDA-MB-231細(xì)胞的體外遷移能力和侵襲力均明顯增強。另外,當(dāng)用Cari

9、poride處理過表達(dá)MT1-MMP的MDA-MB-231細(xì)胞后,增強的體外遷移能力和侵襲力均被減弱。差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 5.對比MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)現(xiàn),MDA-MB-231細(xì)胞中p38 MAPK和ERK1/2的基礎(chǔ)磷酸化水平明顯較MCF-7中高,且具有統(tǒng)計學(xué)意義；但是JNK的磷酸化水平在這兩種細(xì)胞中無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 6.免疫印跡法結(jié)果顯示,Cariporide處理MDA-MB-231

10、細(xì)胞后,p38 MAPK和ERK1/2的磷酸化水平呈時間依賴性降低,具有統(tǒng)計學(xué)的意義,但是JNK的磷酸化水平不受影響。
　　 7.單獨使用Cariporide和MAPK抑制劑(MEK抑制劑PD98059、p38 MAPK抑制劑SB203580和JNK抑制劑SP600125)處理MDA-MB-231細(xì)胞時,體外侵襲實驗和免疫印跡法結(jié)果顯示,MDA-MB-231細(xì)胞的體外侵襲力及MT1-MMP蛋白表達(dá)均明顯下降,具有統(tǒng)計學(xué)的意義；當(dāng)

11、聯(lián)合使用Cariporide和MAPK抑制劑處理MDA-MB-231細(xì)胞時,Cariporide可以分別和PD98059、SB203580協(xié)同性地抑制MDA-MB-231細(xì)胞的體外侵襲力及MT1-MMP蛋白的表達(dá),然而Cariporide和SP600125之間不存在協(xié)同性。
　　 結(jié)論:
　　 1.NHE1介導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的體外侵襲和遷移。
　　 2.NHE1通過調(diào)節(jié)MT1-MMP的表達(dá)和活性介導(dǎo)MD