X射線輻照后對中樞海馬組織損傷作用研究.pdf

1、目的：
　　 構(gòu)建ICR小鼠X射線全腦輻照模型和離體海馬神經(jīng)元輻照模型，研究不同劑量X射線照射后不同時(shí)間點(diǎn)中樞海馬齒狀回的病理損傷，及其對神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的損傷作用、細(xì)胞凋亡、DNA雙鏈斷裂、NBS1、ATM、P53、PUMA等DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)以及細(xì)胞周期改變等情況的影響，探討X射線對中樞海馬齒狀回神經(jīng)的損傷及其機(jī)制，為輻射防護(hù)提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 健康ICR小鼠80只，體重18～22g，雌

2、雄各半。隨機(jī)分為五組（四個不同劑量X射線照射組和一個空白對照組），X射線照射組小鼠麻醉后分別接受0.4Gy、4Gy、10Gy、18GyX射線全腦一次照射，空白對照組小鼠麻醉后作假照射（不予X射線照射）。X射線輻照后4h、12h、24h、48h取小鼠全腦對中樞海馬組織進(jìn)行檢測（同一劑量X射線照射后每時(shí)間點(diǎn)動物數(shù)為4只）。運(yùn)用HE染色檢測顆粒細(xì)胞病理損傷，透射電鏡從形態(tài)學(xué)上觀察中樞海馬齒狀回顆粒細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷，原位末端標(biāo)記(TUNEL)法

3、檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)和γ-H2AX細(xì)胞免疫熒光法檢測中樞海馬細(xì)胞DNA雙鏈斷裂，免疫組化和免疫蛋白印跡法檢測中樞海馬組織NBS1、ATM、P53，PUMA蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測中樞海馬細(xì)胞周期改變情況。結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，分析不同劑量X射線照射后不同時(shí)間，中樞海馬組織的損傷、NBS1、ATM、P53、PUMA蛋白表達(dá)以及細(xì)胞周期改變之間的輻射效應(yīng)關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 (1)病理結(jié)果顯示，

4、對照組齒狀回顆粒細(xì)胞和亞顆粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密，形態(tài)完整、排列整齊，層次清晰，細(xì)胞核飽滿、核仁清晰，無膠質(zhì)細(xì)胞的浸潤。在0.4Gy4h和12h點(diǎn)，齒狀回顆粒細(xì)胞與對照組相似；照射組病理損傷隨時(shí)間的延長呈遞進(jìn)性加重，劑量較大組光鏡下可見齒狀回顆粒細(xì)胞排列稀疏、紊亂，胞膜皺褶，核碎裂。
　　 (2)電鏡結(jié)果顯示，空白對照組中樞海馬細(xì)胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器未見明顯異常，神經(jīng)元形態(tài)正常，核膜完整，染色質(zhì)未見濃染。與對照組海馬齒狀回顆粒細(xì)胞

5、相比較，0.4Gy組照射后各個時(shí)間點(diǎn)齒狀回顆粒細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，偶見齒狀回顆粒細(xì)胞形態(tài)發(fā)生不規(guī)則改變，顆粒細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)稍濃。4Gy組照射后4h觀察到海馬齒狀回顆粒細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則改變，在12h出現(xiàn)局部核膜斷裂，24h和48h出現(xiàn)明顯的線粒體腫脹變性。10Gy組照射后4h與12h觀察到海馬細(xì)胞固縮，核型變小，24h點(diǎn)核膜斷裂明顯,48h點(diǎn)細(xì)胞核有破裂癥狀。18Gy組照射后4h與12h海馬細(xì)胞比10Gy劑量組中相同時(shí)間點(diǎn)固縮更加明顯,48

6、h表現(xiàn)更為嚴(yán)重，有壞死細(xì)胞出現(xiàn)。
　　 (3)單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)結(jié)果顯示，不同劑量X射線照射后，各組隨時(shí)間延長均出現(xiàn)DNA損傷，表現(xiàn)出在4h上升、12h或24h達(dá)到高峰、24h或48hDNA損傷參數(shù)逐漸下降的趨勢；各劑量組間，DNA損傷隨劑量的增加逐漸加重。
　　 (4)不同劑量X射線照射后不同時(shí)間點(diǎn)均可誘發(fā)海馬神經(jīng)元產(chǎn)生不同程度DSBs。同一照射劑量組中，γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)和陽性率均表現(xiàn)為在0.5h內(nèi)迅速升高，

7、1h達(dá)到高峰,4～48h逐漸下降；不同劑量組間，相同時(shí)間點(diǎn)γ-H2AX陽性率，均隨劑量增加而加重。
　　 (5)細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，輻照組在電離輻射后各時(shí)間點(diǎn)海馬齒狀回細(xì)胞凋亡數(shù)均明顯增多（除0.4Gy組）；細(xì)胞凋亡率隨照射劑量增加而增加，并隨時(shí)間的延長逐漸增加。0.4Gy組細(xì)胞凋亡率4-24h較對照組均略增高，但在48h有所回落；18Gy48h細(xì)胞凋亡率急劇降低。
　　 (6)免疫組化結(jié)果顯示，X射線照

8、射組在輻照后各個時(shí)間點(diǎn)中樞海馬NBS1、ATM、P53陽性細(xì)胞數(shù)高于對照組，ATM、P53陽性細(xì)胞率隨照射劑量增加而升高。在0.4～4Gy劑量組，隨著照射后時(shí)間的延長，NBS1蛋白的表達(dá)先升高后降低，在10Gy劑量組NBS1蛋白的表達(dá)持續(xù)升高。
　　 (7)Western-blot結(jié)果顯示，除18Gy48h的ATM、P53、PUMA蛋白表達(dá)較18Gy24h回落外，其余各組ATM、P53、PUMA蛋白表達(dá)均隨著照射劑量的增加以及時(shí)

9、間的延長而增加。照射后同一時(shí)間點(diǎn)，NBS1表達(dá)隨著照射劑量增大，表達(dá)隨之增高；在0.4～4Gy劑量組，隨著照射后時(shí)間的延長，NBS1蛋白的表達(dá)先升高后降低，在10Gy劑量組NBS1蛋白的表達(dá)持續(xù)升高。
　　 (8)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，同一時(shí)間點(diǎn)各劑量組劑量組S期細(xì)胞明顯增多,4Gy、10Gy、18Gy劑量組G2/M期細(xì)胞隨著劑量的增大細(xì)胞數(shù)逐漸增多。
　　 結(jié)論：
　　 (1)0.4Gy、4Gy、10Gy、18Gy

10、X射線全腦輻照后4h、12h、24h、48h不同時(shí)間點(diǎn)均可誘發(fā)齒狀回顆粒細(xì)胞不同程度病理損傷。0.4Gy劑量4h和12h點(diǎn)，齒狀回顆粒細(xì)胞與對照組相似；其余實(shí)驗(yàn)組病理損傷隨時(shí)間的延長呈遞進(jìn)性加重，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　 (2)0.4Gy、4Gy、10Gy、18GyX射線全腦輻照后4h、12h、24h、48h不同時(shí)間點(diǎn)可見齒狀回顆粒細(xì)胞有不同程度的超微結(jié)構(gòu)損傷。即使較小劑量0.4Gy照射后，中樞海馬也存在輕微染色質(zhì)深染；隨著照

11、射劑量的增加，損傷逐漸加重，呈現(xiàn)劑量-時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。
　　 (3)0.4Gy、4Gy、10Gy、18GyX射線全腦輻照后4h、12h、24h、48h不同時(shí)間點(diǎn)均可誘發(fā)齒狀回顆粒細(xì)胞不同程度DNA損傷。同一照射劑量組中，DNA損傷先升高，12h或24h達(dá)到高峰，隨后24h或48h逐漸下降，呈現(xiàn)時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系；不同劑量組間，相同時(shí)間點(diǎn)DNA損傷，均隨劑量增加而加重，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　 (4)不同劑量X射線照射后不同

12、時(shí)間點(diǎn)均可誘發(fā)海馬神經(jīng)元產(chǎn)生不同程度DSBs。同一照射劑量組中，γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)和陽性率均表現(xiàn)為在0.5h內(nèi)迅速升高，1h達(dá)到高峰，隨后4～48h逐漸下降，呈現(xiàn)時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系；不同劑量組間，相同時(shí)間點(diǎn)γ-H2AX陽性率，均隨劑量增加而加重，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　 (5)X射線照射能夠誘導(dǎo)中樞海馬組織發(fā)生細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率隨照射劑量增加以及時(shí)間的延長而逐漸增加，呈劑量—時(shí)間—效應(yīng)關(guān)系。
　　 (6)0.4Gy、4G

13、y、10Gy、18GyX射線全腦輻照后4h、12h、24h、48h不同時(shí)間點(diǎn)中樞海馬NBS1，ATM、P53、PUMA蛋白表達(dá)均隨著劑量的增加而升高，呈現(xiàn)劑量-時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，且和DNA損傷的改變有相關(guān)關(guān)系，提示NBS1、ATM、P53、PUMA蛋白可能參與了DNA的識別和修復(fù)過程。
　　 (7)不同劑量X射線輻照后不同時(shí)間能夠引起不同程度中樞海馬細(xì)胞周期S期、G2/M期發(fā)生阻滯，與照射劑量、照射后時(shí)間相關(guān)。此外，細(xì)胞周期的改變