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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
砷暴露可以導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。本研究的目的是觀察成年小鼠慢性砷暴露以后,大腦海馬的細(xì)胞增殖和神經(jīng)元再生能力是否受到影響;以及停止砷暴露后,海馬的細(xì)胞增殖和神經(jīng)元再生能力是否恢復(fù)正常。此外,為了探索砷誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性損傷機(jī)制,從核酸水平檢測(cè)其是否受到損傷,提供毒理學(xué)證據(jù)。
方法:
在對(duì)海馬神經(jīng)元再生的研究中,將90只小鼠隨機(jī)分成3組。第1組小鼠飲用蒸餾水4個(gè)月(對(duì)照組);第2組小鼠飲
2、用含4.0 mg/L As2O3的水4個(gè)月(染砷組);第3組小鼠飲用含4.0 mg/L As2O3的水2個(gè)月,然后改為蒸餾水,再飲用2個(gè)月(恢復(fù)組)。用電感耦合等離子體質(zhì)譜法對(duì)小鼠大腦和血清中的砷含量進(jìn)行檢測(cè);用HE染色觀察海馬組織病理學(xué)改變;用激光共聚焦顯微鏡鑒定海馬顆粒細(xì)胞層(granule cell layer,GCL)和顆粒細(xì)胞亞層(subgranular zone,SGZ)5-溴-2'-脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2'-d
3、eoxyUridine,BrdU)陽(yáng)性的細(xì)胞作為增殖的標(biāo)志,BrdU+和NeuN+雙標(biāo)記細(xì)胞作為新生神經(jīng)元的標(biāo)志;用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定法(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end-labeling assay,TUNEL)檢測(cè)該區(qū)細(xì)胞凋亡;用Fluoro-Jade C檢測(cè)該區(qū)細(xì)胞的死亡;用Real-timePCR檢測(cè)各組海馬超氧化物歧化酶(super
4、oxide dismutase,SOD)1、SOD2及Wnt3基因的表達(dá)差異;用Moms水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各組小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。
在對(duì)腦組織損傷的研究中,32只小鼠被隨機(jī)分成4組,自由飲用0,1,2和4mg/L As2O3水,觀察了腦組織的病理變化,并用免疫組化的方法檢測(cè)了小鼠腦8-NO2-G的表達(dá)。
結(jié)果:
1、小鼠血清和大腦砷含量
經(jīng)過(guò)2個(gè)月的砷暴露,對(duì)照組小鼠血清和大腦中的
5、砷濃度分別為28±9.4和31±5.0ng/g;染砷組小鼠血清和大腦中的砷濃度分別為42±6.2和60±8.5 ng/g,染砷組小鼠大腦中的砷含量顯著高于對(duì)照組(p<0.05)。再經(jīng)過(guò)2個(gè)月的砷暴露,樣本中的砷含量繼續(xù)升高,染砷組小鼠血清和大腦中的砷濃度分別為61±3.2和74±6.3 ng/g,顯著高于對(duì)照組小鼠血清和大腦中的砷濃度(31±3.5和22±2.4 ng/g,p<0.01),而恢復(fù)組血清和大腦中的砷濃度分別為25±4.4和
6、23±2.8 ng/g,與染砷組相比顯著降低(p<0.01),與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。以上結(jié)果提示,砷暴露以后,砷可以在腦中沉積,當(dāng)砷從飲水中去除,沉積的砷可以排泄到體外。
2、海馬的組織病理學(xué)改變
組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),砷暴露后小鼠海馬神經(jīng)元出現(xiàn)病理?yè)p傷。對(duì)照組(2個(gè)月、4個(gè)月)均無(wú)異常病理改變。經(jīng)過(guò)4個(gè)月的砷暴露,染砷組出現(xiàn)明顯的核固縮,而恢復(fù)組海馬有顯著的改善。2個(gè)月染砷組海馬神經(jīng)元的病理?yè)p傷相對(duì)較輕。<
7、br> 3、砷對(duì)細(xì)胞增殖的抑制及其恢復(fù)
經(jīng)過(guò)2個(gè)月的砷暴露,SGZ/GCL范圍內(nèi),BrdU+細(xì)胞的數(shù)量是104.2±5.4個(gè)細(xì)胞/切片,比對(duì)照組(120.7±12.6個(gè)細(xì)胞/切片)降低,但無(wú)顯著差異。經(jīng)過(guò)4個(gè)月的砷暴露,對(duì)照組、染砷組和恢復(fù)組BrdU+細(xì)胞的數(shù)量分別為111.8±5.6、84.0±2.3和128.5±4.8個(gè)細(xì)胞/切片。與對(duì)照組相比,染砷組BrdU+細(xì)胞的數(shù)量顯著降低(p<0.01),表明砷暴露抑制了
8、細(xì)胞的增殖。與染砷組相比,恢復(fù)組BrdU+細(xì)胞的數(shù)量顯著升高(p<0.01),恢復(fù)組與對(duì)照組無(wú)差別,提示飲水中的砷改為蒸餾水,恢復(fù)了SGZ/GCL中細(xì)胞的增殖。
4、砷對(duì)神經(jīng)元再生的抑制及其恢復(fù)
新的成熟的海馬神經(jīng)元(神經(jīng)元再生)表現(xiàn)為SGZ/GCL中細(xì)胞BrdU和NeuN雙標(biāo)記陽(yáng)性。砷暴露2個(gè)月后,染砷組與對(duì)照組相比,BrdU+和NeuN+雙標(biāo)記細(xì)胞占BrdU+細(xì)胞百分比顯著降低(54±2.7 vs.67±
9、2.3%,p<0.01)。4個(gè)月時(shí),恢復(fù)組BrdU+和NeuN+雙標(biāo)記細(xì)胞占BrdU+細(xì)胞百分比顯著高于染砷組(71±2.2 vs.60±2.8%,p<0.05),并與對(duì)照組相比沒(méi)有差別(71±2.2 vs.73±1.7%,p>0.05)。
5、各組間凋亡及死亡無(wú)顯著差別
每只小鼠SGZ/GCL中計(jì)數(shù)至少1000個(gè)Hoechst染色陽(yáng)性細(xì)胞。經(jīng)過(guò)2個(gè)月的砷暴露,TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)照組為0.58±0.0
10、75%,染砷組為0.65±0.077%,組間沒(méi)有顯著差別(p>0.05)。將砷改成蒸餾水2個(gè)月后,TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)照組為0.67±0.065%,染砷組為0.77±0.063%,恢復(fù)組為0.75±0.087%,各組間沒(méi)有顯著差別(p>0.05)。每只小鼠SGZ/GCL中計(jì)數(shù)至少1000個(gè)細(xì)胞,未見(jiàn)Fluoro-Jade C陽(yáng)性細(xì)胞。
6、海馬SOD1、SOD2及Wnt3的mRNA表達(dá)
經(jīng)過(guò)2個(gè)月的砷暴
11、露,染砷組SOD1/β-actin mRNA比值是0.42±0.0058,較對(duì)照組(0.65±0.013)顯著降低(p<0.01)。經(jīng)過(guò)4個(gè)月的砷暴露,對(duì)照組、染砷組和恢復(fù)組SOD1/β-actin mRNA比值分別為0.61±0.017,0.40±0.0088和0.56±0.0088。與對(duì)照組相比,染砷組SOD1表達(dá)顯著降低(p<0.01),在恢復(fù)組中,SOD1的水平與染砷組相比顯著提高(p<0.01),但并沒(méi)有恢復(fù)至對(duì)照組水平(p<
12、0.05)。
經(jīng)過(guò)2個(gè)月的砷暴露,染砷組SOD2/β-actin mRNA比值是0.29±0.015×10-1,較對(duì)照組0.45±0.0033×10-1顯著降低(p<0.01)。經(jīng)過(guò)4個(gè)月的砷暴露,對(duì)照組、染砷組和恢復(fù)組SOD2/β-actin mRNA比值分別為0.60-0.012×10-1,0.42±0.012×10-1和0.54±0.0088×10-1。與對(duì)照組相比,染砷組SOD2表達(dá)顯著降低(p<0.01),在恢復(fù)
13、組中,SOD2的水平與染砷組相比顯著提高(p<0.01),但并沒(méi)有恢復(fù)至對(duì)照組水平(p<0.01)。
經(jīng)過(guò)4個(gè)月的砷暴露,染砷組Wnt3/β-actin mRNA比值較對(duì)照組降低(p<0.01),但在恢復(fù)組中,Wnt3的水平并沒(méi)有恢復(fù)。
7、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)
在隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)及空間搜索實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過(guò)2個(gè)月的砷暴露,各組間無(wú)顯著差異。經(jīng)過(guò)4個(gè)月的砷暴露,各組間依然無(wú)顯著差異。
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