大腸桿菌BL21(DE3)氨基葡萄糖代謝調(diào)控關(guān)鍵酶的初步研究.pdf

1、氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN，2-amino-2-deoxy-D-glucose)是一類重要的氨基單糖，也是粘多糖和幾丁質(zhì)的組成成分。對(duì)于哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)，氨基葡萄糖是組成粘膜分泌物，結(jié)締組織，皮膚，肌腱，韌帶和軟骨等必不可少的組成成分。骨關(guān)節(jié)炎是一種由于關(guān)節(jié)軟骨退行性變引起的關(guān)節(jié)疼痛和關(guān)節(jié)功能障礙（包括關(guān)節(jié)畸形）的中老年常見疾病。氨基葡萄糖是一種人們廣泛使用的營(yíng)養(yǎng)品，它對(duì)關(guān)節(jié)炎，特別是膝骨關(guān)節(jié)炎具有良好的療效和保健功能[1

2、，2]。研究還表明[3]，口服任何劑量的氨基葡萄糖對(duì)于空腹血糖水平，葡萄糖代謝，胰島素敏感性等幾乎沒有影響，與Ⅱ型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展并無(wú)很大關(guān)系。
　　L-谷氨酰胺:D-果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶，也被稱為氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlcN-6-P Synthase，EC2.6.1.16)。它催化Fru-6-P生成GlcN-6-P，以L-谷氨酰胺(Gln)作為氮供體，反應(yīng)方程如下:
　　D-果糖-6-磷酸+L-谷氨酰胺→L-

3、谷氨酸+D-氨基葡萄糖-6-磷酸
　　它不僅是生物合成UDP-GlcNAc的第一步反應(yīng)同時(shí)也是限速反應(yīng)，為生物合成含氨糖大分子的代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵點(diǎn)[4]。且此反應(yīng)是目前已知唯一的GlcN-6-P生物合成途徑。
　　代謝工程是指通過(guò)優(yōu)化細(xì)胞內(nèi)遺傳和調(diào)控過(guò)程來(lái)增加細(xì)胞某種物質(zhì)產(chǎn)量的生物工程。本研究以代謝工程的設(shè)計(jì)策略對(duì)常見大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行改造，使之具有更強(qiáng)的生產(chǎn)氨基葡萄糖的性能。首先利用λ噬菌體Red同源重組系統(tǒng)對(duì)大

4、腸桿菌BL21(DE3)中調(diào)控GlcN代謝的關(guān)鍵基因:甘露糖特異-磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(manXYZ)，乙酰氨基葡萄糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝酶系統(tǒng)（包括轉(zhuǎn)運(yùn)酶，脫乙酰酶，脫氨酶及其調(diào)控基因:nagBACD-nagE）進(jìn)行了雙操縱子的剔除。通過(guò)測(cè)定比較雙缺失菌株(YP1103)與野生型菌株在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線表明，YP1103不僅不能以GlcN和GlcNAc為碳源生長(zhǎng)，而且利用Glc的能力也有所下降。這不僅證明兩個(gè)操縱子已被成功剔除，同時(shí)也反映出

5、此菌株具備富集GlcN和GlcNAc的能力。后面本文對(duì)大腸桿菌BL21(DE3)氨基葡萄糖合成酶基因(glmS)進(jìn)行了定向改造:在glmS基因中間第225位蘇氨酸后插入6×His標(biāo)簽，并將pET28a載體上其他標(biāo)簽去除，兩者連接后構(gòu)建出表達(dá)載體pETG。經(jīng)優(yōu)化表達(dá)條件，在YP1103菌株中成功實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)。最后使用Ni-NTA親和柱純化蛋白，測(cè)定其活性達(dá)到8.63U/mg，與國(guó)外報(bào)道基本一致[5，6]。
　　綜上，本文利用代謝