PotD、TidD蛋白及谷氨酰胺合成酶的差異表達(dá)對大腸桿菌BL21(DE3)及惡臭假單胞菌F1生物膜生成的影響.pdf

1、生物膜(biofilms)是細(xì)菌吸附在有機或無機介質(zhì)上時，通過分泌含表面多糖、蛋白、DNA的細(xì)胞外基質(zhì)，將菌群包圍其中所形成的復(fù)合體。在自然界中，細(xì)菌主要以生物膜形態(tài)存在。生物膜結(jié)構(gòu)為內(nèi)部菌群提供了物理性防護(hù)，生物膜中的菌體可形成互養(yǎng)共棲關(guān)系協(xié)同進(jìn)行新陳代謝，遺傳物質(zhì)可橫向轉(zhuǎn)移使得進(jìn)化更快，生物膜的形成對微生物提供了生態(tài)學(xué)優(yōu)勢。
　　 生物膜的形成受多種因素影響，外界環(huán)境條件如水文條件、吸附介質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)、光照、溫度等，細(xì)菌內(nèi)在

2、的調(diào)節(jié)機制如密度感應(yīng)系統(tǒng)。細(xì)菌形成生物膜時，與浮游態(tài)相比多種基因差異表達(dá)，差異表達(dá)的基因包括細(xì)菌吸附過程、密度感應(yīng)系統(tǒng)、代謝、應(yīng)答環(huán)境壓力、分子伴侶相關(guān)的基因。營養(yǎng)物質(zhì)對生物膜形成的影響主要體現(xiàn)在影響細(xì)菌的生長速率。生長速率可影響細(xì)菌多種特性，如代謝活性、耐藥性，吸附性和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。環(huán)境溫度、pH對生物膜形成的影響與營養(yǎng)物質(zhì)相似，適宜的溫度、pH可加快生物膜細(xì)菌生長，提高吸附性。流體剪切力對生物膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定有很大作用，高剪切力使生

3、物膜更加致密，生物膜呈纖維細(xì)絲狀，而在層流狀態(tài)下呈單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)。剪切力可影響物質(zhì)轉(zhuǎn)運和胞外多糖的產(chǎn)生。
　　 在前期實驗中利用蛋白組學(xué)研究方法，通過比較PseudomonasputidaF1蛋白表達(dá)的雙向凝膠電泳(2-DGE)圖譜，在不同碳源條件下生長的細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)胰酶消化以及基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間(Matrixassistedlaserdesorption/ionization-Timeofflight(MA

4、LDI-TOF)massspectrometry)質(zhì)譜分析，結(jié)果表明，盡管該細(xì)菌在降解甲苯和乙苯時利用同一個代謝途徑，代謝相關(guān)蛋白在微生物利用不同碳源時的表達(dá)量有所變化。差異表達(dá)蛋白可分為4類，代謝蛋白，轉(zhuǎn)運蛋白，適應(yīng)性相關(guān)蛋白以及其它類型蛋白。利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，比較惡臭假單胞菌浮游態(tài)與生物膜形成過程中許多基因差異表達(dá)。蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳分析表明，與浮游態(tài)相比惡臭假單胞菌在生物膜形成早期有532個差異表達(dá)的蛋白，在生物膜形成晚期有43

5、5個。在早期差異表達(dá)的蛋白中，175個蛋白是特異表達(dá)的，61個蛋白表達(dá)有3倍差距。
　　 本文選取了遺傳背景清晰的E.coliBL21(DE3)，用恒流器模擬自然界中流體環(huán)境，以低營養(yǎng)的M9鹽液為培養(yǎng)基，以玻璃羊毛為吸附介質(zhì)培養(yǎng)E.coliBL21(DE3)，使其在玻璃羊毛上形成生物膜。通過顯微鏡觀察E.coliBL21(DE3)生物膜形成過程，分析出生物膜形成中的粘附聚集階段、微菌落形成階段和生物膜成熟階段。
　　 選

6、取游離態(tài)和生物膜態(tài)表達(dá)差異較大的三個蛋白，分別為腐胺/精胺轉(zhuǎn)運蛋白的底物結(jié)合亞基PotD，與代謝有關(guān)的蛋白TldD和谷氨酰胺合成酶，通過過量表達(dá)，減量表達(dá)和基因敲除的方法，運用激光共聚焦顯微鏡，研究三個基因?qū).coliBL21(DE3)生物膜形成的影響。
　　 通過數(shù)據(jù)庫檢索獲得EcoliBL21(DE3)potD、tldD、glnA基因的全長序列。利用PCR擴增出potD、tldD、glnA基因，將potD基因與質(zhì)粒pET2

7、6b(+)連接構(gòu)建出potD基因過量表達(dá)載體pET26b(+)-fpotD，將tldD基因和glnA基因分別與質(zhì)粒pET28a(+)連接構(gòu)建出tldD基因和glnA基因的過量表達(dá)載體pET28a(+)-ftldD和pET28a(+)-fglnA。將三個基因的反義鏈連接入質(zhì)粒，構(gòu)建出反義核酸載體pET26b(+)-ipotD、pET28a(+)-itldD和pET28a(+)-iglnA，反義載體經(jīng)轉(zhuǎn)錄后生成目的基因的反義RNA，與目的基

8、因的mRNA進(jìn)行互補結(jié)合后干擾目的基因的正常表達(dá)，從而達(dá)到減量表達(dá)的效果;運用九-RED同源重組技術(shù)對目的基因進(jìn)行敲除。
　　 將過量表達(dá)載體pET26b(+)-fpotD、pET28a(+)-ftldD和pET28a(+)-fglnA轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時用SDS-PAGE驗證目的蛋白的表達(dá)。減量表達(dá)載體pET26b(+)-ipotD、pET28a(+)-itldD和pET28a(+)-iglnA

9、同時轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)進(jìn)行反義RNA轉(zhuǎn)錄，運用Westernblotting驗證減量表達(dá)的效果。利用恒流器培養(yǎng)各蛋白過量表達(dá)，減量表達(dá)菌株和缺失菌株形成生物膜，觀察各生物膜的形成狀況，分析目的基因?qū)ι锬ば纬傻挠绊憽?br>　　 SOS修復(fù)是指DNA受到嚴(yán)重的損傷時細(xì)胞處于危急狀態(tài)時被誘導(dǎo)的一種DNA修復(fù)方式，修復(fù)的結(jié)果只是能維持基因組的完整性，提高細(xì)胞的生成率，但留下的錯誤較多，故又稱為錯誤傾向修復(fù)(error-pr

10、onerepair)，使細(xì)胞有較高的突變率。許多細(xì)菌，包括大腸桿菌，沙門氏菌等，能對DNA損傷或失速的DNA復(fù)制產(chǎn)生反應(yīng)即SOS反應(yīng)。SOS反應(yīng)有30多個基因參與，可使細(xì)菌增加DNA損傷耐受性及DNA修復(fù)能力。LexA蛋白是主要的SOS反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，作為轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白行駛功能直至DNA損傷激活RecA。RecA介導(dǎo)LexA自我消化，從而允許SOS基因表達(dá)。因此，RecA表達(dá)水平可以作為評價SOS反應(yīng)程度的可靠性指標(biāo)。多胺（腐胺、亞精胺和精胺

11、）是存在于所有生物體中的脂肪族陽離子。研究被證明多胺通過非共價鍵交互與蛋白質(zhì)、核酸、磷脂和其他酸性物質(zhì)相結(jié)合，能夠影響細(xì)胞膜的透性、基因表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡。因為他們的重要的監(jiān)管職能、生物合成、降解吸收，排泄的多胺是嚴(yán)格監(jiān)管為了保持適當(dāng)?shù)募?xì)胞水平。最近，多胺已被證明調(diào)解RecA的生產(chǎn)，配合LexA控制SOS反應(yīng)調(diào)節(jié)子。研究人員發(fā)現(xiàn)，groES,groEL，tldD，tldE,和gyrA的突變都能提高菌株對CcdB的耐受性，而且

12、在tld缺失菌株中，SOS反應(yīng)被誘導(dǎo)。雖然TldD和TldE被證明在含有pMccB17質(zhì)粒的菌株中，與抗生素的分泌有關(guān)，但是，tldD和tldE基因位于染色體上，而不是質(zhì)粒上，而且，除了TldE蛋白之外，沒有研究表明其他蛋白質(zhì)與TldD有相似的作用。為了研究PotD和TldD與SOS系統(tǒng)的關(guān)系，實驗選取recA，sfiA，oxyR，groES,groEL，gyrA六個與SOS反應(yīng)相關(guān)的基因，以16srRNA為內(nèi)參，利用RT-PCR分析六