皮蠅素HA基因的克隆和在大腸桿菌BL21中的表達.pdf

1、廣西又尹碗去夢禪價沈摘要HA基因是皮蠅I期幼蟲在宿主體內(nèi)移行過程中釋放出來的三種絲氨酸蛋白酶之一，對皮蠅幼蟲成熟和逃避宿主免疫系統(tǒng)起到重要作用。皮蠅素HA具有很矛的抗原性和較強的免疫調(diào)節(jié)功能，是制作重組疫苗的理想候選抗原.隨著對皮、翅丙預防和治療范圍的擴大，以及皮蠅數(shù)量的減少，從幼蟲獲取足夠量的皮蠅素HA已變得越來越困難。因此，利用生物技術生產(chǎn)重組抗原己非常必要汾本文根據(jù)法國提供的PGEMHA克隆質(zhì)粒和HA基因的堿基序列，設計一對分別帶

2、有限制性酶切位點HindII和NotI的引物，利用PCR技術從PGEMHA中擴增出HA基因，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，所擴增出來的DNA片段約為835bp將大小與預計分子量一致的DNA片段純化后連接到表達質(zhì)粒PE丁28b上，再轉化大腸桿菌TGI感受態(tài)細胞，得到的轉化子經(jīng)過分子量大小比較，PCR鑒定和酶切分析以及序歹。，。定、f結果表明，作者得至11的重組子(PET28bHA)中含有HA基因，而且HA基因的堿基序列完全正確。然后，將經(jīng)過鑒定

3、完全正確的陽性克隆，轉化BL21表達菌，用IPTG誘導表達，通過時相表達實驗，發(fā)現(xiàn)在加入IPTG6h后，表達量達到最高。表達產(chǎn)物經(jīng)過NiNTA親和層析柱純化，SDSPAGE檢測為單一條帶，大小約為31KDa。經(jīng)過Westernbloting雜交實驗，純化出來的目的蛋白能與兔抗HA的陽性血清反應，用gelatin作為底物，檢測其酶活性，HA融合蛋白不能降解gelatin。這些研究表明，成功構建的PET28bHA在大腸桿菌BL21中能夠表達

4、，表達的HA融合蛋白具有反應原性，但不具有酶活性。這些為進一步研究HA蛋白的各種特性奠定了基礎。夕關健詞:皮蠅素A基因克隆蛋白表達廣西又夢碩士夢吞價丈一般耗牛的感染率高于黃牛。我國耗牛的平均感染率約為70%，幼年牛的感染率可達90%.感染的強度，每頭牛可有820個，多者可有數(shù)百個幼蟲161牛的皮蠅感染可以造成嚴重的經(jīng)濟損失。Krull(1969)報道，山于奶牛感染皮t，產(chǎn)奶量下降25%[71Beesley(1974)研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)奶量至少

5、會減少15%[“oLudwig和Bueek(1966)證實經(jīng)過治療的皮蠅病牛日增重平均為1.03kg，而沒有經(jīng)過治療的牛日增重只有。.89kg[91。而且皮蠅病能造成宿主免疫抑制(Boular1989ChabauctieNico[asGaulardet試1995)1101121，從而使宿主更易受細菌、病毒或其它寄生蟲的感染，造成的經(jīng)濟損失就很難估計了。有人預測，我國五大牧區(qū)因皮蠅病造成的損失合計約值人民幣數(shù)億元以上。由于蛇傷，受害乳牛減

6、奶約20%，菜牛出肉率減少10%。有的牛只，因“跑蜂”引起外傷，甚至摔死。更為嚴重的是由于皮蠅造成的蛇眼、蛇癱以及屠宰剝皮時造成的殘傷，嚴重地影響牛皮的質(zhì)量[‘3]。蛇眼、蛇癱多分布在牛皮的優(yōu)質(zhì)部位，尤其牛犢皮損害的面積更大，常是蛇傷累累，對牛皮出口和制革工業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生嚴重影響，造成極大的經(jīng)濟損失。在美國，1972年因為皮蠅病造成的損失達1.92億美元(10ian1977)[419，在奧地利，1965年損失近1億先令(Kutzer198

7、4)[“1，在英國采取消滅皮蠅計劃之前，每年損失1300多萬英鎊，希臘每年損失4200多萬美元，意大利單因皮革損失就達1150多萬美元(Macchioni1984)[171。此外，在我國西北、華北以及西藏等牧區(qū)，偶爾有人體病例的報道。因此，對于皮蠅病的有效控制和治療，不但對畜牧業(yè)的發(fā)展有很好的促進作用，而且對制革工業(yè)的發(fā)展和人民群眾的身體健康都大有裨益。在發(fā)現(xiàn)魚藤酮之前，人們普遍采用傳統(tǒng)的手工排除皮蠅幼蟲的方法。但這種方法不但費時，費力